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摘 要

1. 哌啶甲酸衍生物具有巨大的药物价值，可以用于治疗肿瘤，激素分泌问题，心血管问题，流感病毒等。由于目前的化学合成方法成本昂贵，不适应于工业化大规模生产，因此对于低成本，高效率的合成方法的需要十分迫切。2009 年，Kino 课题组发现了中华根瘤菌中存在一种氧化酶SmP4H，它属于2-酮戊二酸依赖的加氧酶，该酶能催化L-脯氨酸转化为顺式-4-羟脯氨酸。哌啶甲酸结构与脯氨酸十分类似，可以期望该酶也能羟基化哌啶甲酸至羟基哌啶甲酸。本文通过构建并验证重组质粒、构建工程菌株并生产SmP4H酶、制备全细胞催化剂、验证反应活性来证明该酶也可以羟基化哌啶甲酸。该生物合成方法有着比传统化学方法操作更简单，成本更低，污染更小的优势。所以本实验的成功验证为今后的生物法大规模工业化生产羟基哌啶甲酸提供了依据和基础，在医药方面的应用也将产生巨大价值。

关键词：2-酮戊二酸依赖的加氧酶 全细胞催化

The Function and Application of 2-ketoglutarate-dependent Oxygenase in the Hydroxylation of Piperidine Derivatives

ABSTRACT

The 3-piperidinecarboxylic acid derivative has a huge medical value and can be used for the treatment of tumors, hormone secretion, cardiovascular, influenza virus and so on. Because current chemical synthesis methods are expensive and are not suitable for large-scale production in factories, the need for low-cost, high-efficiency synthesis methods is urgent. In 2009, Kino's research group discovered the presence of an oxidase SmP4H in Sinorhizobium meliloti, a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase that catalyzes the conversion of L-proline to cis-4-hydroxyl. Pipecolic acid structure is very similar to proline. It would be expected to hydroxylate pipecolic acid to hydroxypipecolic acid. In this paper, I constructed and validated the recombinant plasmids of cloning and expression, and an engineered strain and produced SmP4H oxidase, prepared a whole cell and verified the reactivity to verify that the enzyme can also hydroxylate piperidine acid. The biosynthetic method has the advantages of simpler operation, lower cost, and less pollution than traditional chemical methods. Therefore, the successful verification of this experiment provides the basis and basis for the large-scale industrial production of hydroxypiperidinecarboxylic acid in the future, and the application in medicine will also have great value.

KeyWords: 2-oxoglutarate-dependent oxygenase; Whole cell catalysis

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 羟基哌啶甲酸的生产方法 1

1.2.1 酸水解法 1

1.2.2 化学法 2

1.2.3 生物法 3

1.3 生产羟基哌啶甲酸时底物α-酮戊二酸的供给 3

1.3.1α-酮戊二酸对于脯氨酸羟化反应的影响 4

1.3.2 生物法合成α-酮戊二酸 4

1.4 本论文的研究意义和研究内容 5

第二章 重组质粒的构建与验证 7

2.1 前言 7

2.2 材料和方法 7

2.2.1 实验仪器 7

2.2.2 实验试剂 8

2.2.3 菌种及质粒 9

2.2.4 培养基 9

2.2.5 实验方法 9

2.2.6 检测方法 10

2.3 结果与讨论 10

2.4 本章小结 11

第三章 构建工程菌株并生产SmP4H氧化酶，制备全细胞催化剂并验证反应活性 12

3.1 前言 12

3.2 材料和方法 12

3.2.1 实验仪器 12

3.2.2 实验试剂 12

3.2.3 菌种 12

3.2.4 培养基 13

3.2.5 培养方法 13

3.2.6 实验方法 13

3.2.7 检测方法 14

3.3 结果与讨论 14

3.4 本章小结 16

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 18

参考文献 19

致谢 21

第一章 文献综述

1.1 前言

3-哌啶甲酸衍生物拥有良好的反应活性和生物活性。生物法成功合成羟基哌啶甲酸为今后的大规模工业化生产提供了可能。因为生物合成法有着化学合成法不具备的低成本，低污染，高产率的优势，加上3-哌啶甲酸衍生物具有巨大的药物价值，可以用于治疗肿瘤，激素分泌，心血管，流感病毒等，生物法合成具有广阔的市场前景和巨大的医疗价值。目前, 3-哌啶甲酸衍生物的合成方法多为传统的化学方法, 操作繁杂。 2009 年，Kino^[1] 课题组发现了中华根瘤菌中存在一种氧化酶SmP4H，它属于2-酮戊二酸依赖的加氧酶，该酶能催化L-脯氨酸转化为顺式-4-羟脯氨酸。哌啶甲酸结构与脯氨酸非常相似，可以期望该酶同样羟基化哌啶甲酸至羟基哌啶甲酸。该方法与传统方法比具有操作简单、条件温和、污染小等方面优势，更不需要化学法差向异构法以昂贵的反应前体为原料，能大幅度降低生产成本，使得生物法大规模工业化生产羟基哌啶甲酸具有广泛的应用前景。

1.2 羟基哌啶甲酸的生产方法

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