论文总字数：18835字

摘 要

糖基转移酶（Glycosyltransferases, GTs）是在植物中普遍存在的一种生物催化剂，可以改善受体分子的水溶性、稳定性和糖苷的生物活性。自然界中绝大多数的糖基化反应都是通过糖基转移酶的催化来进行的。因此糖基转移酶在天然产物的生物合成过程中发挥着十分重要的作用。

槲皮素（Quercetin）是一种黄色针状结晶。作为一类天然的黄酮类化合物，槲皮素及其衍生物具有许多生物活性以及药理活性，有很大的药用价值。本课题研究利用糖基转移酶UGT73G1生物酶法催化生产槲皮素-3,4’-二葡萄糖糖苷。实验以大肠杆菌为研究对象，采用分子克隆技术，构建糖基转移酶UGT73G1与蔗糖合酶SUS共表达重组质粒，采用乳糖诱导培养基诱导表达产酶，利用酶法催化合成槲皮素-3,4’-二葡萄糖糖苷。研究各条件对双酶偶联反应体系中产物产量的影响，同时研究不同通透剂对反应的影响。研究表明，当反应时间达12h时，产物的产量达到最大值；催化合成槲皮素-3,4’-二葡萄糖糖苷的最适反应温度为30℃；最适反应pH范围为7.0-8.0；最适宜的通透剂为Triton-100，添加量为2‰。

关键词：糖基转移酶 蔗糖合酶 槲皮素糖苷 全细胞催化

Synthesis of quercetin glycoside catalyzed by recombinant E. coli cells

Abstract

Glycosyltransferases are ubiquitous biocatalysts in plants that can improve the water solubility, stability, and glycoside biological activity of receptor molecules. The majority of glycosylation reactions in nature are catalyzed by glycosyltransferases. Therefore, glycosyltransferases play a very important role in the biosynthesis of natural products.

Quercetin is a yellow needle crystal. As a natural flavonoid, quercetin and its derivatives have many biological activities and pharmacological activities and have great medicinal value. In this study, we studied the production of quercetin-3,4'-diglucoside using the glycosyltransferase UGT73G1 enzymatic method. E. coli was used as the research object. Molecular cloning technology was used to construct a recombinant plasmid for the co-expression of glycosyltransferase UGT73G1 and sucrose synthase SUS. The enzyme was induced by lactose induction medium and quercetin was synthesized by crude extract. The influence of various conditions on the substrate conversion rate in the double-enzyme coupling reaction system was studied, and the target product was quantitatively analyzed.The results showed that the optimum reaction temperature for the synthesis of quercetin-3,4′-diglucoside was 30°C and the optimum reaction pH range was 7.0-8.0. The most suitable permeabilizer was Triton-100 with an increase of 2 ‰.

Key words: glycosyltransferasesucrose synthase ;quercetin glycoside ;whole cell;catalysis

目录

摘 要

Abstract

目录

第一章 文献综述

1.1 前言

1.2 糖基转移酶概述

1.2.1 糖基转移酶的分类与结构特点

1.2.2 UGT的结构功能关系研究

1.2.3 基于蔗糖合酶与糖基转移酶偶联的尿苷二磷酸葡萄糖再生系统

1.3 黄酮类化合物简介及槲皮素糖苷的合成

1.3.1 黄酮类化合物

1.3.2 槲皮素糖苷简介

1.4 本论文的研究目的和内容

第二章 全细胞催化合成槲皮素-3，4’-二葡萄糖糖苷

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 实验器材

2.2.2 实验要用到的菌株和质粒

2.2.3 实验所用的工具酶，分子量标准和试剂盒

2.2.4实验所用的主要试剂

2.2.5 培养基及培养方法

2.3 实验方法

2.3.1 糖基转移酶基因合成及质粒构建

2.3.2 重组大肠杆菌的诱导表达

2.3.3 糖基转移酶活性的测定

2.3.4 槲皮素及其糖苷的液相色谱（HPLC）测定

2.3.5 槲皮素-3，4’-二葡萄糖糖苷产量研究

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 反应时间对槲皮素-3,4’-二葡萄糖糖苷产量的影响

2.4.2 温度对槲皮素-3,4’-二葡萄糖糖苷产量的影响

2.4.3 pH对槲皮素-3,4’-二葡萄糖糖苷产量的影响

2.4.4 通透剂对槲皮素-3,4’-二葡萄糖糖苷产量的影响

第三章 结论与展望

3.1 主要结论

3.2 展望

参考文献

致谢

第一章 文献综述

1.1 前言

糖基转移酶是在植物中是普遍存在的一种十分高效的生物催化剂。自然界中绝大多数的糖基化反应都是通过糖基转移酶的催化来进行的。糖类是自然界中广泛分布的一类重要的有机化合物，是许多种天然产物结构的重要构成部分，医药的天然产物在代谢的过程中会产生许多代谢产物，并且这些代谢产物主要是各种糖基，糖基通过对药物进行作用来对药物的性能进行改善，并且在改善完毕之后提升自身的各种生物活性^[1]。数据库具有不同的生物编码，这些生物编码通过糖基转移酶来产生作用，并且其整体数量超过了65000个，每个氨基酸的排列顺序也大致上可以分为多个类型，总体上包括89个家族^[2]。

基于目前已知的这么多种糖基转移酶的氨基酸序列和结构信息的基础上，为了使得糖基转移酶变得可以识别更加多的具有不同结构的糖基供体以及糖基受体，许多国内外的科学家都正在尝试使用基因工程改造的方法对糖基化过程进行改造。在这种发展机制和背景之下，需要在自然界中存照一种天然的转移酶，借助糖基转移酶的作用来构造一种新型的高效药物，并且将其应用在临床过程当中，这样才能发挥良好的作用。

1.2 糖基转移酶概述

1.2.1 糖基转移酶的分类与结构特点

在糖基化反应的过程当中还可以利用各种糖基酶的催化作用来对蛋白质以及氨基酸进行合成，并且形成糖苷键，这种反应是当前最为常见的反应，并且还能够广泛的存在于细胞内部，广泛参与植物次级代谢产物的生物合成过程，能够将活性糖基供体的糖单体的部分转移到一些特定的糖基受体上。糖基化反应可以改善糖基受体分子的一些理化性质如稳定性、水溶性、脂溶性以及糖苷的生物活性和药理性质^[3-5]。

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