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摘 要

 -丙氨酸是一种潜在的平台化合物，是生产食品添加剂、医药和含氮化学制品的重要前体。在医药、食品和化工等领域的研究和作用日渐突出。目前，-丙氨酸在工业上的生产主要采用了化学合成的方法。但是，化学方法较易产生副产品且需要的条件比较苛刻。因此，利用环境友好型的生物合成方法来生产-丙氨酸越来越受到人们的关注。

本文建立L-天冬氨酸--脱酸酶的高通量筛选方法，构建了1000-2000的突变库，比较选取最优突变菌株56号及134号，对突变体进行蛋白纯化和相关动力学参数的测定。经测量，与未突变菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a-panD_C.g相比，两个突变菌株的酶学常数 kcat/Km分别是其3.5和26.9倍，其催化效率有所提升。转化12 h之后，56号菌株和134号菌株的-丙氨酸的产量分别为14.3 g/L、9.1 g/L，且分别是未突变菌株的1.7和1.1倍，突变使其对于底物L-天冬氨酸有较强的亲和力。比较突变菌株的产-丙氨酸的能力以及对底物的耐受性，表明其一定程度上缓解底物抑制性。

关键词：L-天冬氨酸--脱羧酶 -丙氨酸 高通量筛选 底物耐受性

Study on the Production of -Alanine by Directional Modification of L-Aspartic Acid--Decarboxylase

Abstract

-alanine is a potential platform compound and an important precursor for the production of food additives, pharmaceuticals and nitrogenous chemicals. Its role in food, chemical, pharmaceutical and other fields is becoming increasingly prominent. At present, the production of -alanine in industry mainly adopts chemical synthesis methods. However, chemical methods require more stringent conditions and are prone to produce by-products. Therefore, the use of environmentally friendly biosynthetic methods for the production of strontium-alanine is gaining more and more attention.

This paper establishes a high-throughput screening method for L-aspartate--decarboxylase and constructed a 1000-2000 mutation library. Then compared and selected the best mutant strain No. 56 and No. 134. The mutants were then subjected to protein purification and determination of relevant kinetic parameters. By measurement, the enzyme constants of the two mutants were 3.5 times and 26.9 times that of the non-mutant strain E. coli BL21(DE3)/pET28a-panDC.g, respectively, the catalytic efficiency has improved. After 12 h of transformation, the production of -alanine of strains No. 56 and No. 134 was 14.3 g/L and 9.1 g/L, respectively，which was 1.7 and 1.1 times that of non-mutant strains, respectively, the mutation was shown to have a strong affinity for the substrate L-aspartic acid. Comparing the -alanine-producing ability of the mutant strains and the tolerance to the substrate indicated that it somewhat alleviated substrate inhibition.

Key Words: L-aspartate--decarboxylase; -alanine; High-throughput screening; Substrate tolerance

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 b-丙氨酸 1

1.1.1 b-丙氨酸简介 1

1.1.2 b-丙氨酸的合成方法 1

1.1.3 b-丙氨酸的应用 3

1.2 L-天冬氨酸-a脱羧酶 4

1.2.1 L-天冬氨酸-a脱羧酶介绍 4

1.2.2 L-天冬氨酸-a脱羧酶催化机理 5

1.2.3 L-天冬氨酸-a脱羧酶的应用 5

1.3 定向进化 6

1.3.1 定向进化的研究进展 6

1.3.2 定向进化的策略 6

1.4 本课题研究的意义与主要内容 7

1.4.1 本课题研究的意义 7

1.4.2 本课题研究的主要内容 8

第二章 材料与方法 9

2.1 实验材料与设备 9

2.1.1 主要材料与试剂 9

2.1.2 实验设备 10

2.2 实验方法 11

2.2.1 易错PCR 11

2.2.2 连接转化 11

2.2.3 提质粒 12

2.2.4 纯化方法 12

2.3 培养方法 13

2.3.1 平板培养 13

2.3.2 种子液培养 13

2.3.3 摇瓶发酵培养 13

2.4 衍生化方法 14

2.5 分析方法 14

第三章 结果与讨论 15

3.1 初筛及复筛结果 15

3.2 液相检测结果及突变位点分析 16

3.3 突变株的纯化分析图 17

3.4动力学特征参数分析 17

3.5 突变酶发酵产b-丙氨酸的对比 18

3.6 突变菌株的底物耐受性研究 18

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

致谢 23

文献综述

-丙氨酸

-丙氨酸简介

-丙氨酸，英文名-Alanine，又称3-氨基丙酸。其分子式是C₃H₇NO₂，相对分子量是89.09，形状为无色晶体，不溶于乙醚、丙酮和水，但微溶于乙醇，对水有些许的危害。-丙氨酸分子结构见图1-1。

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