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摘 要

戊二胺是一种合成聚酰胺重要化合物的单体，其生物催化生产具有重要的意义。本文通过基因工程手段，将赖氨酸脱羧酶与几丁质结合蛋白共表达，利用几丁质结合蛋白与几丁质结合功能，将赖氨酸脱羧酶固定在胶体几丁质上进行赖氨酸脱羧酶催化研究。首先，成功构建了融合蛋白表达质粒pET28a-chiBD-cadA，实现目的蛋白表达；然后，对融合蛋白表达温度进行了优化，37℃有最好的表达效果；接着对几丁质结合蛋白结合功能进行研究，结果显示吸附反应后的胶体几丁质具有相近的催化酶活，反应15 min，消耗赖氨酸69.3 g/L；最后，对吸附后的赖氨酸脱羧酶重复利用能力进行研究，重复利用三次后保持原活性的46%。本研究从而对赖氨酸脱羧酶固定化研究提供一定基础。

关键词：戊二胺 赖氨酸脱羧酶 几丁质结合蛋白 融合蛋白 固定化

Immobilization of Lysine Decarboxylase to Produce 1,5-Diaminopentane

Abstract

1,5-Diaminopentane is a monomer for the synthesis of important compounds of polyamides, and its biocatalytic production is of great significance. In this paper, lysine decarboxylase was co-expressed with chitin-binding protein by means of genetic engineering. Using chitin-binding protein and chitin binding function, lysine decarboxylase was immobilized on colloidal chitin for lysine Acid decarboxylase catalysis. First, the fusion protein expression plasmid pET28a-chiBD-cadA was successfully constructed to achieve the target protein expression; then, the fusion protein expression temperature was optimized, the best expression effect at 37 °C; then the binding function of chitin binding protein was performed. The results of the study showed that the colloidal chitin after adsorption reaction had similar catalytic activity. After 15 min reaction, 69.3 g/L lysine was consumed. Finally, the reusability of adsorbed lysine decarboxylase was studied and repeated. After using three times, 46% of the original activity was maintained. This study provides a basis for the study of immobilization of lysine decarboxylase.

Key words：1,5-Diaminopentane; Lysine decarboxylase; Chitin binding protein; Fusion protein; Immobilized

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 绪论 1

1.1 戊二胺简介 1

1.2 戊二胺的合成方法 1

1.2.1 化学法 1

1.2.2 发酵法合成生产戊二胺 2

1.2.3 酶法合成戊二胺 2

1.3 L-赖氨酸脱羧酶研究进展 2

1.3.1 L-赖氨酸脱羧酶介绍 2

1.3.2 L-赖氨酸脱羧酶的催化机理 3

1.4 酶固定化方式研究 4

1.5 本课题研究的内容和意义 5

1.5.1 本课题研究的内容 5

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验材料仪器 6

2.1.1 菌株与质粒 6

2.1.2 酶与主要试剂 6

2.1.3实验仪器 8

2.1.4 培养基 9

2.2 菌株方法 9

2.2.1 微生物培养 9

2.2.2 C. meiyuanensis SYBC-H1和大肠杆菌MG1655基因组提取 9

2.2.3 chiBD与cadA基因的扩增 10

2.2.5质粒的构建 11

2.2.6 胶回收目的基因chiBD与cadA 12

2.2.7基因chiBD、cadA及质粒的双酶切 13

2.2.8 表达质粒构建 13

2.2.9 转化 14

2.2.10 目的基因菌落PCR 14

2.3 酶学性质研究 15

2.3.1 融合蛋白诱导温度优化 15

2.3.2 融合蛋白吸附研究 15

2.3.2 细胞破碎方法 15

2.3.3 赖氨酸脱羧酶酶活测定方法 16

2.3.4 几丁质结合蛋白酶活测定方法 16

2.3.5 赖氨酸脱羧酶固定化研究 16

2.4 蛋白3D结构预测模拟研究 16

第三章 结果与讨论 17

3.1 基因组提取 17

3.2 基因组chiBD与cadA的扩增 17

3.2.1 引物设计 17

3.2.2 目的基因的扩增 17

3.3 目的基因与质粒的双酶切 18

3.4 菌落PCR验证 19

3.5 蛋白质3D结构模拟研究 22

3.6 融合蛋白诱导表达温度优化 23

3.7 几丁质结合蛋白吸附研究 24

3.8 固定化酶的重复利用研究 25

第四章 结论与展望 26

参考文献 27

致 谢 30

第一章 绪论

1.1 戊二胺简介

戊二胺，又称尸胺、1-5-二氨基戊烷或尸毒素^[1]，英文别名1,5-Diaminopentane，相对分子质量102，常温下密度0.873 g/mL，戊二胺结构式如图1-1。

图1-1 戊二胺化学结构式

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