论文总字数：16514字

摘 要

在人们的日常生活中，随着生产力水平的发展，人们越来越关注食品健康与安全，然而在食品的生产的各个方面依旧存在着致病性微生物大肠杆菌与肠毒素，威胁并影响着人们的身体健康。

在传统的检测中，实验周期长、步骤繁琐投入大量人力和物力。而近些年发展出的分子生物技术，还存在不能定量分析的假阳性结果，对于实验环境要求较高、易受到其他因素的干扰；免疫学等其他技术则需要大量的前期投入，一时之间难以广泛使用。

本文将介绍一种新型快速检测技术，这种技术利用特殊的基因探针来与需要被测定的靶序列进行互补配对形成杂交链，再以此，通过在已知的DNA或RNA片段上加上可识别的标记，来检测未知样品的同源程度。构建电化学传感器，用Fc和MB标记的U型DNA单链作为捕获探针固载到金电极表面，再结合纳米材料的独特优势从而达到快速、高效、节约资源等优点来同时检测大肠杆菌和肠毒素。根据已经优化的实验，得到检出限，进行检测，计算出线性方程和相关系数，通过实验回收率进一步说明了实验方法优良的准确性和稳定性。

关键词：核酸纳米探针 电化学 快速检测 大肠杆菌

Abstract

In people's daily lives, with the development of productivity, people are paying more and more attention to food health and safety. However, pathogenic microorganisms such as E. coli and enterotoxin still exist in all aspects of food production, threatening and influencing people’s Physical health.

In traditional tests, a large amount of manpower and material resources are invested in long test cycles and cumbersome procedures. In recent years, the molecular biological technology developed has the false positive results that cannot be quantitatively analyzed. It requires high experimental environment and is easily interfered by other factors; other technologies such as immunology require a large amount of up-front investment. It is difficult to use widely.

This article describes a novel rapid detection technique that uses a special genetic probe to form complementary strands with target sequences that need to be measured to form a hybridization chain, and then to add a known DNA or RNA fragment An identifiable marker to detect the degree of homology of an unknown sample. An electrochemical sensor was constructed and immobilized on the gold electrode surface using Fc and MB-labeled U-DNA single-strands as capture probes, combined with the unique advantages of nanomaterials to achieve rapid, high-efficiency, resource-saving and other advantages to simultaneously detect E. coli and Enterotoxins. According to the experiments that have been optimized, the detection limit was obtained, the detection was performed, the linear equation and the correlation coefficient were calculated, and the accuracy and stability of the experimental method were further demonstrated by the experimental recovery rate.

Keywords: Nucleic acid nanoprobe; Electrochemistry; Rapid detection; E. coil

目录

摘要 II

Abstract III

目录 IV

第一章绪论 1

1.1研究背景 1

1.2大肠杆菌的危害 1

1.3肠毒素的危害 1

1.4传统检测技术 2

1.4.1传统检测技术方法 2

1.4.2传统检测技术的弊端 2

1.5分子生物学技术 2

1.5.1聚合酶链反应技术（常规PCR方法） 2

1.5.2实时荧光定量PCR技术 3

1.5.3高通量PCR技术 3

1.6免疫学检测技术 3

1.6.1酶联免疫吸附技术 3

1.6.2免疫层析技术 3

1.6.3快速测试片法 4

1.6.4高效液相色谱技术 4

1.7其他新型检测技术 4

1.7.1红外光检测技术 4

1.7.2传感器技术 5

1.8本课题的研究意义 5

第二章 基于核酸纳米探针的电化学传感器同时检测大肠杆菌和肠毒素 6

2.1核酸探针的设计原理 6

2.1.1核酸适配体 6

2.1.2核酸探针 6

2.2电化学生物传感器的设计原理 6

2.3纳米材料的选择 8

2.3.1纳米材料的优势 8

2.4实验设计原理 9

2.5实验器材与材料 11

2.6实验方法 11

2.6.1准备工作 11

2.6.2实验 13

第三章结果与讨论 15

3.1标准曲线 15

3.2方法的准确性 17

3.3小结与展望 18

参考文献 19

致谢 21

第一章绪论

1.1研究背景

近些年来，随着国家的深入发展和日益壮大，新型农业技术的改革等很好地满足了人们对食品的需求，人们逐渐过上丰衣足食的生活，但与此同时对食品的要求不断提高，主要是因为随之而来的是由食品不良品质所带来的身体健康危害日益显著，有关食品安全卫生的不良新闻加剧了这种恐慌。在我们食品生产的各个环节，例如：生产、加工、储存、运输等，每一个环节都存在被微生物污染的可能性。我们的食物一旦被污染，细菌就会在此上面大量繁殖从而引起食物的变质损害，会引起人体的各种不适，诸如腹泻、肠炎等，严重的甚至会引起死亡。食品安全问题越来越受到人们和社会的广泛关注。大肠杆菌菌群数则是对食品质量与安全的重要考察标准之一。

1.2大肠杆菌的危害

大肠杆菌又称为大肠埃希菌，它是人和许多动物肠道中数量最多且非常重要的一种细菌，可以运动，周身有鞭毛，没有芽孢，能发酵糖类食物从而产酸产气，它本身不具有致病性^[1]。但是这之中有几种血清型的大肠杆菌会造成食源性疾病从而对人体产生巨大影响^[2]，引起人类各种疾病对人体产生不同程度的危害。2013年美国曾爆发大肠杆菌疫情，2014年英国也发生汉堡疑似被大肠杆菌污染而引起人体中毒案件^[3]。大肠杆菌与人类息息相关却又时刻引起我们的注意，若食物被大肠杆菌污染，轻则引起头痛、腹泻等症状，重则危害肠道系统甚至是生命安危。

1.3肠毒素的危害

肠毒素，在某些致病性例如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等中就会产生肠毒素^[4]。肠毒素同样对人体有危害，会引起人体肠道的病变，甚至会诱发一百多种疾病，轻则引起色斑、便秘重则引起胃肠道神经功能紊乱。这些毒素对于老人和小孩尤其应该注意。

1.4传统检测技术

1.4.1传统检测技术方法

传统的检测技术，在国家食品安全标准（GB 4789.3-2010）中规定，现在主要推行并且依旧在实施中的传统检测方法分为有两种，大肠菌群MPN计数法和大肠杆菌平板计数法。前者是根据大肠杆菌在肉汤中是否产气初步进行判断阴性和阳性，再通过MPN查表得到结果。后者是通过稀释菌液接种VRBA平板，再计数其中可疑的菌落，再接种至肉汤进一步研究。其操作步骤和实验材料可参考《食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠菌群计数》^[5]。

1.4.2传统检测技术的弊端

在传统检测方法中，主要是对微生物的形态大小特征以及理化特性等进行检测，它的准确性和灵敏性相对较高，但实验操作步骤要求较高且相对繁琐，周期较长，还可能需要大量人员、物资的投入。

近年来，随着科学技术的快速发展，生物技术的不断提高，人们也在探究对于食品中大肠杆菌和肠毒素快速检测的方法。在此背景下，研究快速、灵敏度高、特异的食源性大肠杆菌检测方式对食品卫生与检验有着十分重大的意义。

1.5分子生物学技术

1.5.1聚合酶链反应技术（常规PCR方法）

PCR技术的基本原理是，在以四个脱氧核糖核苷酸、模板DNA和引物的存在作为基础再通过模板DNA聚合酶得到的酶促反应使得DNA片段和基因在体外具有特异性于此同时再迅速的放大。主要步骤是首先是通过离心沉降或过滤处理细菌细胞，并对其进行处理，再从样本中提取DNA，用PCR扩增靶细胞，对DNA的特定序列和最终放大的序列进行探查或电泳^[6]。PCR技术检测的优越之处在于其较高的灵敏度，正因如此目前已得到广泛的应用，但对于大肠杆菌的定量分析存在较大难度，还存在易产生假阳性问题。

1.5.2实时荧光定量PCR技术

该技术建立在常规PCR技术之上，实时聚合酶链反应是对反应系统进行特异性的添加。荧光物质不但可以使放大的产品得到标记，也可以对反应进行实时的监测，最后根据标准曲线进行测试与分析。这与常规PCR方法相比，它具有更加强的特异性、灵敏度，还使得操作得到进一步的简化，更加具备了定量的功能。它的不足之处则在于每次只能最一种物质进行定量分析，不能达到多量高效的目标。

1.5.3高通量PCR技术

高通量PCR技术是PCR技术中的最新研究成果，已经不再是一次只能检测一种物质的技术。它改变成为可以同时检测多个目标细菌或基因的一项技术，即在相同的反应体系中可以同时加入了多种引物或者多个DNA片段。

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