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摘 要

本文利用一种独特的方法，通过形成动态交联键，包括动态共价键和离子键，以制备可注射型双网络（DN）水凝胶，并且将其作为支架材料培养细胞，有望应用于软骨修复。首先用高碘酸钠氧化海藻酸钠，制备具有一定氧化度的氧化海藻酸钠，作为交联剂与羧甲基壳聚糖发生席夫碱反应形成第一层网络结构，然后引入钙离子交联，海藻酸钙形成第二层网络结构，从而形成双网络水凝胶。该凝胶具有可调节性，可通过调节原料配比来调节凝胶的成胶时间。高分子溶液和细胞悬浊液相混合，在溶液体系转变为凝胶体系之前，通过注射器针孔注射形成原位3D细胞封装。DN水凝胶是模拟细胞外基质的理想材料，实验表明，小鼠3T3成纤维细胞在DN凝胶体系中能够完成正常的细胞增殖与分化。

关键词：海藻酸钠 羧甲基壳聚糖 席夫碱反应 双网络水凝胶

Construction of Injectable Double-Network Hydrogels

for Cell Delivery

Abstract

Herein we present a unique method of using dynamic cross-links,which are dynamic covalent bonding and ionic interaction,for the construction of injectable double-network (DN)hydrogels,with the objective of cell delivery for cartilage repair.On purpose of improving the biodegradability of alginate,commerically alginate was oxidized using Sodium Periodate.Carboxymethyl Chitosan and Oxidized Sodium Alginate formed the first network,while calcium alginate formed the second one.The gelation time of the DN hydrogel were tunable by changing the chemical components.In situ 3D cell encapsulation could be easily performed by mixing cell suspension to the polymer solutions and transferred through a syringe needle before sol-gel transition.Cell proliferation and mediated differentiation of 3T3-Swiss albino of mouse were achieved in the DN hydrogel extracellular matrix.

Keyword: Alginate;Carboxymethyl Chitosan;Schiff Base Reaction;Double-network Hydrogels

目录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 绪论 1

1.1软骨组织工程 1

1.1.1 引言 1

1.1.2 关节软骨结构与功能 1

1.1.3 关节软骨损伤及修复 2

1.1.4 组织工程用水凝胶支架 3

1.2 天然高分子基水凝胶 4

1.2.1 胶原 4

1.2.2 明胶 4

1.2.3 海藻酸盐 4

1.2.4 壳聚糖 6

1.3 合成高分子基水凝胶 7

1.3.1 聚乙烯醇（PVA） 7

1.3.2 聚丙烯酸（PAA）及其衍生物 8

1.5 多功能水凝胶 8

1.5.1 可注射型水凝胶 8

1.5.2 双网络水凝胶 9

1.8 本文思路 9

1.8.1 氧化海藻酸钠的合成与表征 9

1.8.2 羧甲基壳聚糖/氧化海藻酸钠水凝胶的合成 10

1.8.3 双网络水凝胶的合成与表征 11

1.8.4 MTT评估CMCS/OSA水凝胶以及DN水凝胶的细胞毒性 12

第二章 实验部分 13

2.1 药品和仪器 13

2.2 实验方法 14

2.2.1 氧化海藻酸钠的合成 14

2.2.2 氧化海藻酸钠实际氧化度的测定 14

2.2.3 傅里叶变换红外光谱测试 15

2.2.4 CMCS/OSA水凝胶的合成 15

2.2.5 CMCS/OSA水凝胶的饱和溶胀度测试 15

2.2.6 双网络水凝胶的制备及其饱和溶胀度测定 15

2.2.7 MTT评估CMCS/OSA水凝胶以及DN水凝胶的细胞毒性 16

第三章 结果与讨论 17

3.1 傅里叶变换红外光谱测试 17

3.2 实际氧化度的测定及其影响因素 18

3.3 CMCS/OSA水凝胶的性质 20

3.3.1 成胶时间测定 20

3.3.2 饱和溶胀度测定 21

3.4 DN水凝胶的制备及其饱和溶胀度测定 22

3.4 MTT评估CMCS/OSA水凝胶以及DN水凝胶的细胞毒性 24

第四章 结论与展望 27

4.1 结论 27

4.2 展望 27

参考文献 28

致谢 30

第一章 绪论

1.1软骨组织工程

1.1.1 引言

组织工程技术是将工程学原理应用于细胞生物学和材料科学领域，以修补或代替因意外损伤或老化等造成功能丧失的人体组织和器官。与传统的人工替代物相比，组织工程技术有着非常明显的优势，通过体外诱导细胞增殖分化所形成的新生组织器官，不仅具备与原组织器官相同的生理功能，还能有效防止体内免疫排斥反应的发生。

关节作为人体运动的枢纽，具有缓冲应力、承担载荷等重大作用^[1]。意外损伤和常见性关节疾病例如关节炎、滑膜炎等，都是引起软骨组织退化的主要原因^[2]。

一方面，人体的关节软骨组织属于特殊的结缔组织，其内部没有血管，故其自修复能力很差。另一方面，目前临床上各种对于软骨缺损的治疗方法的效果均不理想，且传统的治疗手段有很大的局限性。

软骨组织工程就是体外培养细胞，并将细胞和生物活性因子固定在支架材料上，然后将支架材料植入缺损部位，最终细胞在人体内增殖、分化，同时支架材料不断降解而被人体吸收利用^[3]。

1.1.2 关节软骨结构与功能

人体的关节软骨组织属于结缔组织，但与一般结缔组织不同的是，关节软骨组织内部没有血管、淋巴管、神经等结构，因此一旦发生软骨缺损，细胞就无法快速迁移到受损部位进行自修复，所以关节软骨的自修复能力很差。

关节软骨组织是由少量软骨细胞和大量细胞外基质（ECM）组成的^[3]。其中软骨细胞主要起到合成分泌细胞基质蛋白质的作用，而细胞外基质（ECM）所占软骨总体积的比例大致在98vol.%，ECM作为关节软骨的主要成分，是由胶原、蛋白多糖、透明质酸、水以及少量的糖蛋白和其他蛋白质大分子组成的^[3-5]。关节软骨内部的水分占湿重的70wt.%左右，是细胞间进行物质交换的介质，也是关节组织的润滑剂；而胶原则占软骨干重的60-80wt.%，其中绝大部分组成为II型胶原，胶原构成软骨内的网架结构，主要起到支撑

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