论文总字数：21099字

摘 要

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）作为一种天然的生物高分子，具有水溶性、可塑性、 生物降解性、可食用等优良的性质，在农业、食品、医药及化妆品等行业中展现出广阔的应用前景。目前，γ-PGA的生物制造仍然存在原料成本高、合成效率低及重复发酵菌株生产性能下降等问题，严重制约着γ-PGA大规模生产效益和普及化应用水平。同时，大部分生物发酵过程仍消耗大量的粮食作物，非粮作物的开发和利用显得尤为重要。菊芋具有耐干旱、易种植、产量极高、价格便宜，作为一种新型的廉价碳源而广受关注。为了挖掘菊芋这种能源经济作物在γ-PGA工业化生产中的运用，本课题组前期分离筛选得到一株不依赖谷氨酸能够利用菊糖合成γ-PGA的生产菌株Bacillus amyloliquefaciens NX-2S。通过分子生物学手段研究发现，Bacillus amyloliquefaciens NX-2S中含有的菊粉水解相关酶与其他大部分已报道的菊粉酶存在明显差异，因此需要进一步鉴定该种新型水解酶。

本课题从聚谷氨酸非依赖产生菌B.amyloliquefaciens NX-2S中，通过生物信息学挖掘，数据库分析该野生菌株可能负责菊糖利用的相关水解酶CscA，通过大肠杆菌E.coli异源表达验证其功能和测定其酶学性质参数及底物特异性等，之后通过过表达实验验证其菊粉水解酶在野生菌株B. amyloliquefaciens NX-2S中负责菊糖利用的功能。

关键词：谷氨酸非依赖菌株 γ-聚谷氨酸 Bacillus amyloliquefaciens NX-2S 新型菊粉水解酶

Identification about new inulin hydrolase of glutamic acid-independent producing stain Bacillus amyloliquefaciens

Abstract

γ-PGA is obtained by polymerizing L-glutamic acid and D-glutamic acid by γ-amide bond, and has various advantages due to its structural properties such as high water solubility, edible , Biodegradability, etc., in the cosmetics, environmental protection, medicine, food, agriculture and other fields have good prospects for development. The strain used in this subject is a strain called Bacillus amyloliquefaciens NX-2S, which can synthesize polyglutamic acid without the addition of glutamic acid. In the course of the study, it was found that the strain was able to use inulin and had reduced sugar in the product. It was speculated that the polyglutamic acid-independent producing bacteria might express some kind of inulinase.

In this study, we used bioinformatics to extract the related protease components of the inulin, and then analyze the possible new inulin hydrolase by database. Then we purified the new inulin hydrolyzate and determined its enzymatic properties and substrate specificity. The proteolytic gene was knocked out and overexpressed, and its hydrolytic activity on inulin was verified. In order to study the enzyme capable of hydrolyzing inulin in Bacillusamyloliquefaciens NX-2S, the strain was induced by a large number of cells, and then a large amount of pure enzyme was used to study the series of properties of the new inulinase.

KEYWORDS: glutamic acid-independent producing stain γ-PGA Bacillus amyloliquefaciens NX-2S

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1菊粉酶 1

1.1.1菊粉酶的分类 1

1.1.2菊粉酶的来源 2

1.1.3菊粉酶的性质 2

1.1.4菊粉酶的用途 3

1.1.5菊粉酶的研究进展 4

1.1.6菊粉酶的催化机制 4

1.2本课题立题意义 5

1.3研究内容 6

第二章 菊粉水解相关的基因工程菌的构建与鉴定 7

2.1 前言 7

2.2 材料与方法 7

2.2.1菌株与质粒 7

2.2.2酶、药品及试剂盒 7

2.2.3实验仪器 7

2.2.4重组质粒的提取 8

2.2.5将目的基因导入感受态细胞 8

2.2.6目的基因的检测与鉴定 8

2.3 结果与讨论 8

2.3.1野生菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S新型水解酶的挖掘 8

2.3.2 重组质粒pET-CscA的构建 9

第三章 酶的纯化及酶学性质鉴定 12

3.1引言 12

3.2材料与方法 12

3.2.1材料 12

3.2.2实验步骤 13

3.3 结果与讨论 15

3.3.1 酶学性质的研究 15

3.3.2新型菊粉水解酶的过表达和放大发酵 18

第四章 结论与展望 22

4.1结论 22

4.2展望 22

参考文献 24

致 谢 28

第一章 文献综述

1.1菊粉酶

菊粉酶（inulinase，EC 3.2.1.7）是一类β-2,1-D 果聚糖酶，它能够从果聚糖的非还原端逐个切下单糖。有很多生物体中含有菊粉酶，不过菊粉酶最多也是最主要的来源就是那些显微镜下才能看到的微生物。有关的菊粉酶的研究在上世纪80年代开始日益增多^[1,2]。这将近二十年来许多的国家都开始深入地研究菊粉酶的相关性质。我国对菊粉酶的研究也开始变得广泛起来，无论是和菊粉酶有关的菌株筛选还是相关的酶性质方面，研究都逐渐变得非常的广泛^[3]。目前，就研究而言，非粮原料菊芋的生物炼制自然离不开高效关键水解酶的挖掘。

1.1.1菊粉酶的分类

根据菊粉酶对底物作用的方式也就是酶切果聚糖链的方式，从而把它划分为内切酶和外切酶，其中低聚果糖就是上述说的菊粉内切酶在作用于菊粉分子内部产生的产物，外切酶的作用方式则不太一样，它是在非还原性末端起效，对应的产物是还原糖果糖^[4]。菊粉在菊粉内切酶的作用下变成低聚果糖按量来计算，大约为4万-5万/吨，而在菊粉外切酶作用下形成的果糖约为8500-10000/吨。此外，一系列的研究通常显示菊粉内切酶的活性比菊粉外切酶高^[5]。譬如，菊粉内切酶中的Inulinase Aspergillus niger ，它的酶活力大小是156.0 U/mg，而菊粉外切酶中的Levanase Bacillus licheniformis 14580的酶活大小是987.0 U/mg，还有一种外切酶也就是本课题要研究的新型菊粉水解酶CscA Bacillus amyloliquefaciens NX-2S1，它的酶活约为995.0 U/mg。

图1.1菊粉酶的作用方式

1.1.2菊粉酶的来源

查阅相关资料发现到现在为止，能大量生产菊粉酶的微生物有Aspergilus sp、Penicillium sp、Bacillus sp、Clostridium sp、Pseudomonas sp、Arthrobacter sp、Staphylococcus sp、Xanthomonas sp、Kluyveromyces sp、Cryptococcus sp、Pichia sp、Sporotrichum sp和Candida sp这几类。同时，也有研究发现酵母类微生物产菊粉酶的能力比真菌和细菌都要强，酵母属中的Pichia sp、两株Kluyveromyces fragilis、Cryptococcus aureus和Kluyveromyces marxianus具有工业化生产菊粉酶的潜力[6]。

1.1.3菊粉酶的性质

酶的来源不一样，那么它的结构肯定会有差别，从而造成酶分子量的大小不同。从相关的文献我们可以了解到，50-150KDa左右的区间是菊粉内切酶的分子量的大概大小范围，外切酶的酶分子量的大小则在最低40KDa和最高300KDa区间内，比较之后发现外切的分子量总体来说要大一些。

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