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摘 要

本实验通过安瓿瓶保藏冻干菌体的恢复培养，经平板涂布及斜面转接培养，最终筛选得到了生长状况良好，转化能力强的氧化葡萄糖酸杆菌菌株。考察了该菌的生长特性和培养基中碳源浓度对其生长的影响，以及转化反应液所处条件对菌体膜山梨醇脱氢酶活性的影响，最终获得了该脱氢酶催化反应的最适宜条件。

实验结果显示，摇瓶培养基中以D-山梨醇做为碳源、以酵母浸粉做为氮源时，在30℃、150 rpm条件下，培养64 h，能够取得较大量的所属菌株。随着发酵培养基中D-山梨醇浓度的增加（20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L），发酵液中生物量逐渐减小，这表明碳源对其生长有抑制作用，最终得到最适宜的碳源浓度为20 g/L。

本实验对生物转化反应的静息细胞浓度及pH对转化反应的影响进行了研究。最终得出，以D-山梨醇为底物，以氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞为酶源的生物转化反应的最适宜条件：温度为30℃、pH值为5.5、静息细胞浓度0.22 g/L(装液量10 ml)，即此时静息细胞膜山梨醇脱氢酶活力可达到最高。

关键词：氧化葡萄糖酸杆菌 静息细胞 山梨醇脱氢酶 转化反应

Study on the Culture of Gluconobacter oxydans and the Activity of Sorbitol Dehydrogenase

Abstract

In this experiment, the regenerated culture of freeze-dried bacteria was preserved by ampoule, and the strain of Gluconobacter oxydans with good growth and good conversion ability was obtained by plate coating and slope transfer. The effects of the growth characteristics of the bacteria on the growth of the bacteria and the effect of the reaction conditions on the activity of the sorbitol dehydrogenase in the bacterial membrane were investigated. Finally, the dehydrogenase catalyzed reaction The most suitable condition.

The results showed that D-sorbitol was used as carbon source in shake flask culture medium, and yeast leaching powder was used as nitrogen source. After incubation at 30 ℃ and 150 rpm for 64 h, a large amount of strain could be obtained. With the increase of D-sorbitol concentration (20 g/L, 40 g/L, 60 g/L, 80 g/L) in the fermentation medium, the biomass in the fermentation broth gradually decreased, which indicated that the carbon source had an inhibitory effect on its growth , And finally the most suitable carbon source concentration of 20 g/L.

In this study, the effects of resting cell concentration and pH on the transformation reaction were studied. The optimum conditions for the biotransformation reaction of D-sorbitol as the substrate and the resting cells of the oxidized Gluconobacter oxydans as the enzyme source were as follows: the temperature was 30 ℃, the pH was 5.5, the resting cell concentration was 0.22 g/ L(liquid volume 10 ml), that is, at this time resting cell membrane sorbitol dehydrogenase activity can reach the highest.

Key words:Oxidized Gluconobacter; Resting cells; Sorbitol dehydrogenase; transformation reaction

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 1

第一章 绪论 1

1.1 引言 1

1.1.1 治疗糖尿病药物的作用原理 1

1.1.2 米格列醇 1

1.2 研究进展 2

1.2.1 氧化葡萄糖酸杆菌 2

1.2.2 山梨醇脱氢酶 2

1.2.3 氧化葡萄糖酸杆菌培养条件优化研究 3

1.2.4 氧化葡萄糖酸杆菌细胞膜山梨醇脱氢酶性质研究 3

1.3 选题的意义和研究内容 4

1.3.1 选题的意义 4

1.3.2 主要研究内容 4

第二章 氧化葡萄糖酸杆菌生长特性的研究 5

2.1实验材料 5

2.1.1菌种 5

2.1.2 培养基 5

2.1.3 主要药品和试剂 6

2.1.4 主要仪器和设备 7

2.2实验方法 7

2.2.1菌种的恢复培养（活化） 7

2.2.2 菌种的培养 8

2.2.3 生物量的测定（比浊法） 8

2.2.4 产物L-山梨糖的测定及标准曲线的绘制 10

2.2.5 发酵液中碳源的初始浓度对菌种的影响 11

2.2.6 静息细胞的制备 12

2.3结果与讨论 12

2.4本章小结 14

第三章 生物转化反应最适条件的研究 15

3.1 生物转化反应 15

3.2 转化反应的影响因素 15

3.2.1 静息细胞浓度对转化反应的影响 15

3.2.2 反应液pH对转化反应的影响 16

3.3 结果与讨论 17

3.4本章小结 19

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 22

致 谢 25

第一章 绪论

1.1 引言

糖尿病是由于胰腺分泌胰岛素不足所造成的代谢紊乱性疾病，现已经成为继肿瘤之后对人体健康危害最大的非传染性疾病^[1]。按照发病机理的差异，糖尿病可分为两种类型，即I型糖尿病和II型糖尿病。当前，II型糖尿病较为常见，而且患者数量占糖尿病患者的大多数。按照治疗糖尿病机理的差异^[2]，目前有三种糖尿病患者可以服用的药物，其中α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物对患者的血糖浓度控制较好，现在已成为治疗糖尿病的主要药物。

1.1.1 治疗糖尿病药物的作用原理

α-葡萄糖苷酶的关键作用就是把人体内的多糖水解为更小的单糖，进而有利于被人体吸收利用。按照α-葡萄糖苷酶的作用方式，可以将其分为外切糖苷酶和内切糖苷酶两大类^[3]。α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用机理为，抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而达到降低糖尿病患者的血糖水平的目的，其作用机理为竞争性抑制作用，所以此类药物并不能完全抑制人体内单糖的吸收，其效果只是延缓了单糖的吸收过程，使得人体对单糖的吸收更平均^[4]。

1.1.2 米格列醇

米格列醇(Miglitol)是1-脱氧野尻霉素的N-羟乙基衍生物，是由德国Bayer公司于20世纪80年代研制并上市的一种新型α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药物^[5]。其降糖效果比阿卡波糖和伏格列波糖更为有效，副作用小，已在欧洲一些国家作为治疗II型糖尿病高效，安全的药物投入临床使用，但尚未进入国内市场^[6]。

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