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摘 要

酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum是一种适于木质纤维素同步糖化发酵产酸的菌种。本次设计针对氧气对酪丁酸梭菌的影响，对它进行分子改造，通过测定计算出突变率达81.56%，并且没有突变回复现象。将野生菌和突变菌分别从第一代培育到第十代，选择差别最大的第一代和第十代。然后在配制培养基的时候配制一个高氧的21%，在高氧培养基中加入第一代野生菌，在另一个第一代野生菌中加酸成PH=1，在第一代突变菌加酸成PH=1、最后继续培养第十代野生菌。每隔4、8、12、16、20、24个小时对四个样进行转接、提取、萃取，将得到的沉淀质量进行比较，发现突变菌的生长情况更好。加入内标、甲氧氨基盐酸盐、N-甲基-N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺，利用气相色谱分析得出含有高氧21%O₂野生菌比厌氧野生菌的抗氧化性能更差，突变菌比野生菌在高氧和强酸的条件下抗氧化性能更好。

关键词：酪丁酸梭菌 分子改造 耐氧化 培养

Molecular Modification of Clostridium tyrobutyricum

to Improve Oxidation Resistance

Abstract

Clostridium tyrobutyricum is a strain suitable for the simultaneous fermentation of lignocellulose. In this design, the effect of oxygen on Clostridium tyrobutyricum was studied by molecular modification. The mutation rate was 81.56%, and there was no mutation recovery phenomenon. The wild and mutant bacteria were cultivated from the first generation to the tenth generation, the choice of the largest difference between the first generation and the tenth generation. And then in the preparation of the medium when the preparation of a high oxygen 21%, in the high-oxygen medium by adding the first generation of wild bacteria, in another first generation of wild bacteria added acid PH = 1, in the first generation of mutant bacteria Add acid to PH = 1, and finally continue to cultivate the tenth generation of wild bacteria. The samples were transferred, extracted and extracted at 4, 8, 12, 16, 20 and 24 hours respectively. The results showed that the growth of mutant bacteria was better. N-methyl-N- (trimethylsilyl) trifluoroacetamide was added to the internal standard, methoxyamino hydrochloride, N-methyl-N- (trimethylsilyl) trifluoroacetamide, and gas chromatography The antioxidant properties of the mutant bacteria than the wild bacteria in the high oxygen and strong acid under the conditions of better antioxidant properties.

Key Words:Clostridium tyrobutyricum；Molecular modification；Resistance to oxidation；culture

目 录

摘 要

Abstract

第一章 文献综述

1.1 酪丁酸梭菌的背景

1.2 分子改造

1.3培养基选择

1.4 提高耐氧化性能方法

1.5质谱

1.6 本课题的研究手段和内容

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.2.1 主要试剂配制 5

2.2.2 II型内含子Clostron的获取 6

2.2.3 重组质粒的构建 6

2.2.4 Cty_2061基因插入失活载体的构建 6

2.2.5 Cty_2061基因插入失活重组菌株的筛选 7

2.2.6 培养基RCM的配制 7

2.2.7野生菌和突变菌突变率分析 7

2.2.8 加酸加氧培养转接 8

2.2.9 提取处理及代谢组学 8

2.2.10 表型组学分析 9

2.2.11 质谱分析 9

第三章 结果与分析

3.1 野生菌和突变菌突变率分析

3.2 突变菌与原始菌代谢层面分析

3.3 突变菌与原始菌表型组学分析

第四章 结语

参考文献

致谢

第一章 文献综述

1.1 酪丁酸梭菌的背景

酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum适于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸。一般成双或者是呈短链的形式进行排列，但是有的时候会变成长链或卷丝状，很多能形成周生鞭毛。Clostridium tyrobutyricum不会将明胶进行水解。它在普通肉汤中不能很好地存活，但是在含有硫乙醇酸盐的肉汤中却可以很好地存活并且快速地成长，在培养了2天或者3天之后，在管底会形成絮状的沉淀。它是呈革兰氏阳性的，其细胞壁含有DL-二庚基二酸，它的唯一细胞壁糖是葡萄糖。通过在显微镜下的观察，可以测出酪丁酸梭菌的表面菌落直径为0.5mm。它的形状是呈圆形的，看上去像有一条小小的尾巴，然后有一个突出的小头，它的颜色是偏透明的，像是一个个的小蝌蚪^[6]。（见图1）。

图1 酪丁酸梭菌显微镜下状态

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