论文总字数：21921字

摘 要

青霉素酰化酶具有比较高的催化酰化以及去酰化特性，我们在药品生产中对其大量应用，可以水解青霉素钾盐等获得合成β-内酰胺抗生素的重要中间体，还可以用于合成青霉素和头孢菌素类抗生素，具有广泛的底物特异性。尽管我们对青霉素酰化酶已经有了比较深入的研究，但性能仍然难以满足需求，我们需要深入研究青霉素酰化酶结构，从而可以为高性能酶的改造与进一步开发奠定基础，这对酶法合成β-内酰胺类抗生素具有重大意义。

本文从实验室自行筛选的Achromobacter xylosoxidans来源的青霉素酰化酶PGApx02出发，对PGApx02进行定点饱和突变，初步筛选得到高效合成头孢丙烯的突变子，并研究其高效合成能力的原因。主要研究工作如下：

1.通过序列及结构的比对并查阅文献，确定PGApx02活性中心周围的关键氨基酸残基αR145、αF146、βF24，其中βF24是最为关键的突变位点，因此选取βF24进行饱和突变。

2.筛选成功构建的突变子，得到在头孢丙烯合成中效果较好的突变子βF24A，还对合成头孢丙烯过程中一些参数进行了测定，发现突变子βF24A达到产物最大积累量所需的时间只需要野生型的一半，并且最大转化率和野生型相比更是高出3.2倍，母核有91.2%能够转化为产物，合成水解比上升了5.8倍。并对野生型PGApx02及突变子βF24A对NIPAB、头孢丙烯、D-HPGMe的稳态动力学常数进行了研究。

关键词：青霉素酰化酶 突变体 头孢丙烯

site-saturating mutagenesis of Penicillin G Acylase and Its Application in Antibiotic Synthesis

ABSTRACT

Penicillin G acylase (PGApx02) from Achromobacter xylosoxidans was screened from our laboratory, which has independent intellectual property rights. The gene accession number is KY792595. The enzyme was successfully cloned and expressed in Escherichia coli. The overexpression of PGApx02 was achieved through the optimized culture conditions.

1. Structure analysis of PGApx02: The structure of PGApx02 was successfully analysed by molecular replacement method. Structure diagram of PGApx02 was drawn by Pymol. We identified the active pocket site based on the analysis of crystal structure, and found the key amino acids αR145、αF146、βF24 around the active site through sequence and structure comparison, which were played important roles in the interaction between PGA and substrates. Therefore, we selected one of the conserved sites βF24 for the saturation mutation.

2. High efficiently catalytic synthesis of cefprozil of mutant: We constructed the saturation mutagenesis of βF24 and screened these mutants for the systhesis of cefprozil. βF24A was found indeed efficient at synthesis of cefprozil by the experimental verification. At the same time, some parameters in the process of synthesis of cefprozil were studied and found that the time of maximum product accumulation of mutant βF24A reached was only half of wild type. The maximum conversion was 3.2 times higher than the wild type. The conversion of 7-APRA catalyzed by mutant βF24A was 91.2%. The (vs/vh1)_int was increased 5.8 times. Then the steady-state kinetic constants of wild-type and mutants were studied.

Keywords: Penicillin G acylase; Sitedirectedmutagenesis; Cefprozil

目录

摘要 II

ABSTRACT i

目录 2

第一章 文献综述 4

1.1 研究概况 4

1.2 青霉素酰化酶来源 5

1.3 青霉素G酰化酶的催化机制 5

1.4 关于青霉素G酰化酶与其在抗生素生产当中应用的现状 6

1.5 大肠杆菌青霉素G酰化酶的改良 6

1.6 研究意义与内容 7

第二章 PGApx02的结构改造及其在头孢丙烯合成中的应用 9

2.1 前言 9

2.2 实验材料 9

2.2.1 实验试剂 9

2.2.2 实验仪器 10

2.3 实验方法 10

2.3.1 PGApx02与N末端亲核水解酶家族氨基酸序列和结构比对 10

2.3.2 PGApx02β24F定点饱和突变 10

2.3.3 PGApx02β24F突变体的筛选 11

2.3.4 PGApx02β24F突变体粗酶液制备 12

2.3.5 PGApx02纯酶液制备 12

2.3.6 蛋白浓度测定 13

2.3.7 合成头孢丙烯反应体系 13

2.3.8 高效液相色谱法（HPLC）检测底物的含量 13

2.3.9 PGApx02βF24突变体合成头孢丙烯 15

2.4结果与讨论 15

2.4.1 PGApx02与N末端亲核水解酶家族氨基酸序列和结构比对 15

2.4.2 PGApx02β24F突变体构建结果与合成头孢丙烯筛选 17

2.4.3 PGApx02纯化结果 18

2.4.4 PGApx02WT和βF24A合成头孢丙烯反应进程曲线 19

2.4.5 野生型PGApx02及突变子βF24A动力学常数测定 20

2.5 本章小结 21

第三章 结论与展望 21

3.1 结论 22

3.2 展望 22

参考文献 22

第一章 文献综述

1.1 研究概况

目前世界，青霉素、头孢霉素及其衍生物在世界抗生素市场中占据主要的位置^[1]。这些抗生素都是β-内酰胺类抗生素中的一员。由于此类药物积年累月的广泛应用，细菌对于这种抗生素的耐药性一直在持续提高，对于抗生素的改造势在必行，半合成β-内酰胺类抗生素的生产，是解决这一难题的主要途径^[2]。

由于青霉素分子上有2种酰胺键,因此存在2类酰化酶:β-内酰胺酶(打开青霉素分子的β-内酰胺环)和青霉素酰化酶(仅水解青霉素的侧链部分)。酰化酶对青霉素的活性共有三类:第一类是优先水解青霉素G，称为青霉素G酰化酶(PGA);第二类是优先水解青霉素V的青霉素V酰化酶(PVA);(3)专一性水解氨苄西林的被称为氨苄西林水解酶的酶。PGA与PVA的水解性质基本相同。

请支付后下载全文，论文总字数：21921字