论文总字数：17777字

摘 要

威兰胶是由鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）分解而得可溶性胞外多糖，过去的名称为S-130，威兰胶多糖的水溶液具有很好的流变性能，它的的流变特性能够得到很好地控制，正是由于威兰胶的这些特性，在工业和农业上可以作为增加产品的粘度、稠度和乳化的程度到目前为止，美国的美国凯可公司是在国际上唯一的拥有产业化技术的公司，但是有关威兰胶的生产的情况是严加保密的，然而在国内，对此微生物多糖的研究到目前还未见公开的报到。磷酸葡萄糖变位酶（PGM）是催化葡萄糖-6-磷酸到葡萄糖-1-磷酸的转化。威兰胶合成途径中的关键酶是磷酸葡萄糖变位酶（PGM）。我们希望利用基因工程技术从Sphingomonas sp.基因组中扩增出PGM基因，转化入原始菌株中，然后在T7启动子的作用下过表达，以期增加威兰胶产量的目的。实验结果表明，PGM-MCS成功转入Sphingomonas中，并通过三亲本结合的方法挑选出了Sphingomonas sp.-pgm菌株，且威兰胶产量提高11.9%。

关键词：威兰胶；磷酸葡萄糖变位酶（PGM）；基因工程技术；三亲本结合；威兰胶产量。

Abstract

Welan gum is a soluble extracellular polysaccharide that is secretion of Sphingomonas sp.. The past name is S-130. The polysaccharide solution has good rheological properties.It can be control the rheological properties of aqueous phase, It is expected to be used as thickener, suspending agent and emulsifier in all fields of industrial and agricultural production. So far, the Kaike of American is the only company that has possessed Industrial Technology used internationally, but the production situation is strictly confidential. Domestic research on this microbial polysaccharide has not been reported in public. Glucose phosphate variable allozyme (PGM) catalyzed glucose 6-phosphate to glucose-1-phosphate transformation is the Welan gum precursor in the biosynthesis pathway of key enzyme.We used gene engineering technology to ampliy PGM gene from the genome of Sphingomonas sp., then convert.

Into the original strain, in under the action of the T7 promoter expression, to improve the purpose of Welan gum production,Experimental results show that PGM-MCS successfully transferred to the Sphingomonas, and through a combination of the three parents selected strains of phingomonas sp.-pgm and Welan gum yield increased by 11.9%.

Keywords: Welan gum; PGM; Genetic engineering technology; Three parental combination; Welan gum production.

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2威兰胶的理化性质及其应用 2

1.2.1威兰胶的理化性质 2

1.1.2威兰胶应用 3

由于 3

1.3 工业威兰胶合成研究现状 3

1.4本实验的研究内容 3

1.5本课题解决的问题采用的研究手段（途径） 4

第二章 材料与分析方法 5

2.1 菌株质粒与培养条件 5

2.1.1菌株 5

2.1.2培养基 5

2.1.3培养条件 5

2.2 实验仪器与试剂 5

2.3目的基因提取与重组质粒构建 7

2.3.1鞘氨醇单胞菌CGMCC 2428的培养 7

2.3.2鞘氨醇单胞菌CGMCC 2428基因组的提取 7

2.3.3 DNA 的琼脂糖电泳 8

2.3.4 凝胶回收 8

2.3.5 DH5α制备 8

2.3.6 重组质粒的构建 9

2.3.7 大肠杆菌的转化及质粒接合转移 10

2.3.8 DNA的酶切 11

2.3.9 外源DNA片段在质粒载体中的克隆 11

2.4 结果与讨论 12

2.4.1 PGM基因的扩增 12

2.4.2 基因片段及表达载体 12

第三章 发酵数据 14

3.1材料与方法 14

3.1.1实验仪器 14

3.1.2菌种 14

3.1.3 培养基及培养条件 14

3.1.4 三亲本的结合 14

3.1.5 代谢工程菌生长特性的考察研究 15

3.2分析方法 15

3.3结果与讨论 16

3.3.1原始菌株和SP-pgm的OD₆₀₀及葡萄糖的消耗量的比较 16

3.3.2威兰胶的产量结果： 16

第四章 结果与展望 18

4.1实验结论 18

4.2 展望 18

参考文献 19

致谢 22

第一章 文献综述

1.1前言

现如今高分子化学合成材料大量的涌入我们生活，过度的依靠石油资源和不易分解而造成的环境问题已经引起我们的担忧。所以开辟环境友好型的高分子原材料就成为当今各国竞相研究的热门了^[2]。微生物多糖的特点：(1)多糖的优良的性质和它在生活中的使用价值；(2)可以通过筛选出合适的菌种在受控制的条件下进行生产；(3)它的提取工艺的可行性；(4)该微生物多糖还不含毒素。微生物多糖在工业生产与生活的很多范围中都具有普遍的使用价值，可以代替许多价钱不菲的化学制品^[3]。就近几年来看，研究者们研究出很多新的具有科学内涵和商业使用价值的微生物多糖。其中，由微生物生成的威兰胶具备多方面的性质和水溶液的独特流变性能已经吸引起了工业领域研究者们的眼球^[4]。国内外的科学工作者在威兰胶应用方面已经展开了很多的研究，特别是最近几年以来，并且在某种程度上获得了相应的成就，但就代谢途径的控制、菌种选育及过程控制研究的比较少。就威兰胶的研究工作来看，研究者们将重心放在了结构表征，流变学性能的研究以及相关应用范围的开辟。由于合成路径和原理研究的缺乏，威兰胶的合成效率都低，生产成本较高等问题阻碍了其大规模生产和使用。对威兰胶菌种选育，威兰胶合成途径关键酶——磷酸葡萄糖变位酶的过表达加强威兰胶的生物合成和过程调控的研究具有首要的理论与现实的意义。据文献记载，结冷胶产生菌P. eloder ATCC 31461 中编码从葡萄糖-1-磷酸合成糖核苷酸前体所需要的酶的基因为pgmG、ugpG、ugdG、tgpG、rmlB、rmlC、rmlD^[5]。其中pgmG 编码的蛋白质PGM 是一种双功能的蛋白质，与Sphingomonas paucimobilis S7 生产的PGM蛋白质的相似性有83%，与其他革兰氏阴性菌产生的PGM/PMM 蛋白质有37-53%的的相似性^[6]。

威兰胶（welan gum）是一种胞外杂多糖^[4]，属于鞘多糖中的一种，这主要是因为其结构与鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）中某些菌株分泌的酸性夹膜杂多糖有相似之处。它的组成分子量中含有D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖，侧链由单一的L-鼠李糖或L-甘露糖组成^[7]。连接鼠李糖的概率约占 2/3，此外约有1/2的四糖片断上带有乙酰基和甘油基团^[8,9]，分子的重复结构单元如图 1所示^[10]。威兰胶具有使食品增加稠度稠、悬浮、等效果，在工农业中有着广泛的应用前景^[11~14]，特别是在工业上。

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