论文总字数：15424字

摘 要

冬虫夏草又名虫草，是中国传统名贵草药之一，有数百年的入药历史，清代文献便有记载生长，采摘和使用。其药用价值极高，具有补气健脾、增强免疫力的功效，又可抑制癌细胞生长，故目前临床上还可用于辅助治疗肝癌、肺癌等病症。同时虫草风味独特，在某些地区亦可作为一种高级食材。经过对虫草菌的有效成分的提取实验，发现虫草可提取出的活性物质有虫草酸（D-甘露醇）、多糖类、虫草素、氨基酸、腺苷类、无机盐和微量元素。科学研究表明虫草的药用价值高低主要取决于虫草中诸如虫草素、虫草酸和多糖的含量高低。故本实验将在已有文献指导的情况下,进一步研究如何提高虫草中虫草素、多糖和虫草酸的有效产量，主要将探究培养基中的碳源、氮源最佳条件以及光照、温度、pH等因素对虫草菌产量的影响。同时研究实验中各种其他条件对虫草活性成分产量的影响，为今后工业冬虫夏草发酵提供理论指导。

关键词:冬虫夏草 虫草多糖 甘露醇 发酵工艺

Optimization of traditional Cordyceps sinensis fermentation process

Abstract

Coedyceps sinensis, also known as Cordyceps, it is one of rare tradition Chinese herbal medicine, used as medicine with hundreds of years, Qing dynasty has been documented growth, picking and usage. Cordyceps has high medical value, it could enhance the effectiveness of immunity and could also inhibit the growth of cancer cell, so used as treatment of lung and live cancer. As well Cordyceps has unique taste, so it can also use as food. Modern research shows that Cordyceps can be extracted from the active substance contained D-mannitol, polysaccharide, cordycepin, amino acid, adenosine, inorganic salts and trace elements. It is generally believed that medical value of Cordyceps depends on the amount of polysaccharide and Cordyceps acid. So this experiment mainly research on that with the guidance in the literature, the media condition for further improve the yield of polysaccharide and Cordyceps acid , at the same time, explore the impact of other conditions on yield to provide theoretical guidance for industrial fermentation.

Key words:Cordyceps sinensis, Cordyceps acid, yield of plysaccharide, fermentation

目录

第一章 文献综述 1

1.1.冬虫夏草简介 1

1.2 冬虫夏草药理活性及作用 1

1.2.1 虫草多糖 1

1.2.2 虫草酸 2

1.2.3 核苷类物质 2

1.3 发酵技术研究综述 3

1.4本课题研究目的及意义 4

第二章 冬虫夏草中有效成分的提取和检测 5

2.1实验材料 5

2.1.1 实验仪器 5

2.1.2 实验试剂 6

2.2实验方法 6

2.2.1 虫草有效成分的提取 6

2.2.2 虫草菌生长性能的测定 7

2.2.3 虫草多糖的测定 7

2.2.4 葡萄糖的标准曲线的绘制 7

2.2.5 配制虫草酸的测定所用试剂 8

2.2.6 虫草酸的测定 8

2.2.7 虫草酸标准曲线的绘制 9

2.2.8 核苷类物质的测定 9

2.2.9 核苷类物质标准曲线的绘制 10

2.3 结果 10

第三章 虫草菌的培养及优化 11

3.1 虫草菌碳源与氮源的优化 11

3.1.1 实验试剂 11

3.1.2 实验仪器 11

3.1.3 菌种的活化 12

3.1.4 液体种子培养 12

3.1.5 发酵基础培养基 12

3.1.6 不同碳源对虫草菌生长及活性物质产量的影响 12

3.1.7 不同氮源对虫草菌生长及活性物质产量的影响 13

3.1.8 有效成分的提取及测定 13

3.2 结果与讨论 13

3.2.1 不同碳源组对虫草菌生长及各活性物质产量的影响 13

3.2.2 不同氮源组对虫草菌生长及各活性物质产量的影响 16

3.2.3本章小结 17

3.3结论与展望 18

3.3.1 结论 18

3.3.2 展望 18

文献参考 18

致谢 21

1. 文献综述
   1. 冬虫夏草简介

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)又名虫草，由真菌寄生于蝙蝠蛾幼虫体内^[1]，于冬季吸收幼虫体内营养，春季气候改变时从幼虫体内生长而出，外形与草相似而闻名^[2]。在中国，虫草主要分布在川藏等较高海拔的山区和丘陵区^{[2, 3]}，清代《本草从新》记载：“四川嘉定府所产者最佳^[4]，云南贵州所出者次之”由此可见其分布规律及采摘历史。因全球气候改变，野生冬虫夏草数量越来越少，濒临绝迹，故而目前市面上冬虫夏草主要为人工养殖。即使如此，冬虫夏草因其独特的风味而跻身高级食材，同时又具有极高的药用价值，临床上用于治疗肝癌，肺癌及化疗放疗后红细胞下降的症状。

1.2 冬虫夏草药理活性及作用

研究得出，冬虫夏草可提取出的活性物质包含虫草酸（D-甘露醇）、多糖类、虫草素、氨基酸、腺苷类、无机盐和微量元素等^[5]。这些物质统称为虫草的药理活性物质。虫草多糖、虫草酸和虫草素^[6]是现代医学所认可的冬虫夏草中的活性物质。

1.2.1 虫草多糖

经研究，冬虫夏草中最为主要的药理活性物质是虫草多糖，其含量可占虫草总体干重的2.9%~7.6%^[8]。查阅文献得知，虫草多糖是20多种特殊单糖或者多糖的总称，其中常见的糖类主要有葡萄糖，半乳糖，甘露糖等，而有的特殊菌种还含有阿拉伯糖等其他种糖，这取决于菌种生长环境的差异，含量极小因而此处不做过多讨论。虫草多糖的临床理化性质研究解明其具有提高免疫力、抗癌细胞、治疗肺结核的功效，同时还可以降低血糖^[7]。虫草多糖目前有三个主要来源：1.野生虫草直接提取，2.人工培养虫草工艺提取，3.发酵培养通过菌液提取。而应用最广，生产周期最短的方法目前是发酵提取。

实验室常用的检测多糖的方法主要有：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法、比色定量法，HPLC法等。综合考虑，本实验采用的方法为苯酚-硫酸法，另外同时采用DNS法排除还原糖的影响。

1.2.2 虫草酸

虫草酸(D-甘露醇)也是冬虫夏草中的一种重要活性药理物质，经程秀芳等人测定，虫草酸的含量约占虫草总干重的3.60%。该成分可以抑制各种致病细菌以及真菌的生长，因此可用于治疗脑内出血，心肌梗塞，血栓等心脑血管疾病，又可以利尿，排出人体自由基^[6]，是一种重要的药物成分。为了进一步了解虫草酸的各种特性，需将其提取，本实验将虫草菌丝分置于索式提取器中，用纯乙醇反复提取直至无色，提取液用离心机离心，离心结束后过滤并定容至100ml，经实验测得菌丝粉中虫草酸含量为165.8mg/g。而实际虫草发酵粉中虫草酸的含量因为会受到气候和菌种不同而略有差异，一般情况在人工子实体虫草中约为29~85mg/g，显而易见，菌丝中虫草酸的含量远远高于人工子实体^[16]。

虫草酸的提取方法主要有水提取法和醇提取法，虫草酸的实验室提取与多糖的提取类似，本实验采用的是比色法，因为比色法的优势在于不受虫草中其他还原糖的干扰，同时比色法的精确度比较高。

1.2.3 核苷类物质

虫草中的核苷类活性物质主要为虫草素，又称虫草菌素，蛹虫草素等，虫草核苷物质是首次从真菌类药物中提取出的抗生素药物。作为一种天然产物，虫草核苷对于内脏的滋养作用特别明显，活性核苷物质从中医角度来看，对于治疗偏头痛，气血不足，颈椎增生具有显著的疗效因而广泛入药，而在西医角度具有促进新陈代谢，抑制肿瘤细胞生长的作用，同时近年来也作为一种重要的抗凝血药物。核苷类物质可溶于水和甲醇，不溶于氯仿、冷酒精和液体苯^[17]。目前主要的测定含量的方法有高效液相色谱法，紫外光吸收法等。现在，因为研究的深入，核苷类物质的含量也可被作为衡量虫草质量的指标。

1.3 发酵技术研究综述

因为环境的改变，野生虫草濒临绝迹，并且人工养殖虫草因周期较长、产量也不足够工业消耗，所以虫草的价格越来越高。而前文已说明，各种活性物质在虫草菌中的含量较天然或人工虫草子实更高，又因虫草菌适宜大量生产用于工业发酵，所以研究虫草菌的发酵和工艺的优化可以提高虫草各种活性成分的产量，以降低生产成本，扩大虫草菌的产量而使虫草菌的研究得以更加深入。孙琳杰^{[23 ]}等人的研究文献提出冬虫夏草在深层发酵情况下最优培养条件为24℃、摇床转速170rpm，培养基pH6.5，10%的接种量，每500ml装液量150ml，菌丝生长最佳碳源为葡萄糖(浓度2%)，氮源为豆饼粉(规格0.2%)，无机盐条件为0.2%的KH₂PO₄ ，0.075%的MgSO₄ ·7H₂O。此培养基体系可取得比较好的培养效果。与此同时，发酵培养箱的温度，光照，接种量，菌种类型等因素都会影响虫草发酵的最终产量。赵桂云^[24]等人针对液体培养基的碳源氮源最佳配比进行了研究，结果表明在100ml培养液中，蛋白胨含量1g，葡萄糖和蔗糖含量分别是15g和10g，再向其中加入蛹蚕粉2g的情况效果最佳。而张伟等人则观察到，在冬虫夏草的培养液体系中，最适碳源是葡萄糖，淀粉和玉米浆冻干粉，最适氮源为酵母粉，蛋白胨和黄豆粉。他们的实验提出最佳液体培养基的配方为：有效含量为1.0%的葡萄糖，玉米浆冻干粉含量1.7%，酵母粉含量0.5%，黄豆粉含量2.3%。另外此培养基中，麦芽汁的含量约为1.0%。这里还有一份研究报告表明，虫草子实体在分化形成的过程中如果向其施加约为0℃的低温刺激，将可以诱导子实体的形成。同时研究发现虫草菌的子实体在增长过程中还需要比较高的适度，以充足的水分高速生长，因此在子实体的成长期需控制培养基的水含量不能低于60%，相对湿度以95%~100%为适宜。另外，在子实体的生长过程中微弱的光照条件同样可以影响子实体的生长，体现出子实体的向光性生长。

总而言之，在实验室条件下冬虫夏草菌的液体培养基最适碳源为葡萄糖^[23,24]，最适氮源为蛋白质^[24,25]，必需无机盐为无水MgSO₄和K₂HPO₄^[23,27]。另外在实验室发酵过程中还会受到温度的刺激达到昼夜10℃左右^[26]、曝气量、光照条件、接种量和菌种的不同的影响。本实验旨在通过文献指导以理论实验推导出最适培养基配方和生长条件，为工业虫草发酵提供理论基础。

1.4本课题研究目的及意义

本实验通过探究冬虫夏草在发酵过程中的最适碳源、氮源和无机盐比例和最佳生长条件，可以为进一步研究虫草菌的研究提供支持，同时可以为虫草扩大规模投入工业化发酵生产提供理论指导。

1. 冬虫夏草中有效成分的提取和检测

根据文献，虫草菌在发酵过程中能够产生与野生冬虫夏草药理活性相似的物质，它们主要为虫草酸，虫草多糖和虫草素。目前虫草多糖含量的测定主要方法是采取水提法来提取然后用苯酚-硫酸法和DNS法来综合测定，虫草酸的含量测定主要本实验主要是以乙醇提取以后用比色法测定，虫草素含量的测定也是用醇提法提取以后采用高效液相来精确测定。

虫草菌发酵实验的基础在于各活性物质含量的精确测定，本实验根据已有文献和报道^[7]各种检测方法建立起的较为完善科学的虫草菌药理活性物质的检测技术，为工业发酵工艺提供指导。

2.1实验材料

2.1.1 实验仪器

表2-1 实验仪器

2.1.2 实验试剂

表2-2 实验试剂

2.2实验方法

2.2.1 虫草有效成分的提取

将虫草菌接入摇瓶，经过一周的培养，取出摇瓶。将摇瓶内培养液倒入250ml离心瓶，设定转速8000r/min,温度4℃，离心时间30分钟。离心结束取上清液，其中10ml标记胞外多糖置入-80℃冰箱封存，另外再取10ml离心上清液标记为胞外虫草酸冷冻封存。离心沉淀物用蒸馏水冲洗3次，得到沉淀物即为虫草菌的生长菌团。置入烘箱烘干直至恒重，取等重三分沉淀烘干物于三个相同圆底烧瓶，按顺序加入8ml蒸馏水、8ml 50%乙醇、8ml 75%乙醇，震荡使菌团尽量溶解。将恒温水浴锅温度设定为95℃，水浴时长1.5小时，提取结束后进行第一次离心提取，离心机转速为12000r/min,离心15分钟，离心后上层清液分别置入3支离心管标记好，暂时冻存以备后取。第一次的离心沉淀物再依次加入7ml的蒸馏水、50%乙醇、75%乙醇，再次进行水浴，1.5小时以后再次离心，转速时长与之前相同，第二次离心结束将两次离心提取液混合，将3支离心管标记，于-80℃冰箱低温冷冻保存。

本操作中蒸馏水、50%酒精、75%酒精提取的活性物质分别为虫草多糖、虫草酸、虫草素。

2.2.2 虫草菌生长性能的测定

将本实验离心所得沉淀置入干燥箱，设定温度65℃干燥至恒重，称量重量并记录。

2.2.3 虫草多糖的测定

将之前冻存的虫草多糖离心管取出解冻，以1000Da膜透析3h，温度为4℃(冰浴)，移取一定体积加蒸馏水稀释至特定浓度。透析结束立刻取稀释后溶液1ml进行冰浴冷却，加入浓度为5%的苯酚溶液0.5ml，同时向试管内加入5ml浓硫酸，加入过程要迅速，摇匀后密封进行沸水浴20分钟，水浴结束冷水冲淋冷却10分钟，使用紫外分光光度计测OD，波长540nm，每一次测定都要配置一个蒸馏水对照组。

2.2.4 葡萄糖的标准曲线的绘制

取相同试管10支标号，按照0.1~0.9毫升分别吸取配制好的标准葡萄糖液，加蒸馏水补至1.0ml。将所有试管冰浴，在每支试管中加入0.5ml 5%苯酚溶液，加入后震荡使其混匀。此时立刻逐滴加入浓硫酸，加入过程尽量缓慢保证试管放热量较少，滴加完毕再次震荡摇匀，加塞沸水浴20分钟，水浴结束后迅速用冰水冷却10分钟，以加入1ml蒸馏水且未加入葡萄糖的试管作为空白标定调零，在540nm波长处测定所有浓度葡萄糖试样的紫外吸光度。

表 标准曲线制作过程

经数据处理，绘制标准曲线如图2-1，得标准曲线线性回归方程为

Y=0.1741*X 0.01075，R²=0.9939

图2-1 葡萄糖的标准曲线

2.2.5 配制虫草酸的测定所用试剂

实验使用的试剂为：0.1% L-鼠李糖、0.015mol/L高碘酸钠、Nash试剂

2.2.6 虫草酸的测定

将之前实验冻存的虫草酸试管取出解冻，用移液枪移取特定体积试液，加蒸馏水稀释至特定倍数。另取一个空白试管，用移液枪取0.5ml稀释后的待测试液，将其与之前配制好的浓度为0.015mol/L高碘酸钠溶液混合，并震荡摇匀。在约20℃的环境静置10分钟并加入0.1%L-鼠李糖溶液同时加入Nash试剂2ml。将试管53℃水浴加热15分钟显色，测定紫外吸光度，波长为413nm。每一次测定都要配置一个蒸馏水对照组。

2.2.7 虫草酸标准曲线的绘制

本实验对虫草酸含量的测定采用了比色法，因为比色法的精确度较高。取5支相同试管，分别用移液枪移取1ml、2ml、2.5ml、5ml、10ml之前配制好的标准虫草酸溶液。将所有试管加蒸馏水水补至10ml，配制成不同浓度的标准D-甘露醇溶液。另取洁净试管若干，吸取不同浓度的标准D-甘露醇溶液1ml，与0.015mol/L的高碘酸钠溶液混匀震荡，室温静置10分钟使其充分反应。再分别向其中加入2ml L-鼠李糖溶液，边滴加边震荡。加入完成再缓慢加入4ml Nash试剂，加入完毕将所有试管标号放入水浴锅，以53℃水浴加热，显色时间为15分钟。水浴完毕测定在波长413nm处测定紫外吸光度，每次测定均需蒸馏水做空白对照。

图2-2 虫草酸的标准曲线

经数据处理虫草酸的线性回归方程为Y=0.09746*X 5.82001*10^-4；R²=0.99975

2.2.8 核苷类物质的测定

将先前冻存的虫草素试管取出解冻，旋转蒸发仪蒸干，残渣加蒸馏水2ml溶解完全。移取旋蒸干后溶解的试液800μl，以12000r/min的转速低温离心5分钟。用注射剂缓慢吸取，通过过滤膜过滤至液相分析瓶中分，使用高效液相色谱仪分析，每份样品的分析时间都为45分钟。

2.2.9 核苷类物质标准曲线的绘制

精密称取虫草素粉末5mg，用蒸馏水溶解定容至10ml，得到浓度为50mg/ml的标准溶液。将标准溶液分别配制出0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5g/L的不同浓度的溶液，然后用高效液相色谱仪分析，每个样品45分钟。

图2-7 虫草素标准曲线

经分析虫草素标准曲线为：Y=0.00378*X 8.63151*10^-4，R²=0.9999

2.3 结果

在虫草菌的初步培养完成以后，将发酵完毕的虫草进行干燥称重，干重为23.87g/L、胞外虫草多糖含量为1.17mg/ml、胞外虫草酸含量为0.63mg/ml、胞内虫草多糖含量为0.44mg/ml、胞内虫草酸含量为2.67mg/ml、胞内虫草素含量为56.24μg/g。

虫草菌的培养及优化

整个虫草菌发酵的过程，培养基各项条件中，适宜的碳源和氮源能最为显著提高活性物质如虫草多糖、虫草酸及虫草素的产量。麦焯棉^[30]等人基于研究发现，培养基的碳源氮源不同将会改变生长出的虫草菌的活性物质含量^[31]。因此本章将研究各不同的碳源及氮源条件下的虫草菌生长状况和活性物质的不同产量。

3.1 虫草菌碳源与氮源的优化

3.1.1 实验试剂

表3-1 实验试剂

3.1.2 实验仪器

表3-2 实验仪器

3.1.3 菌种的活化

PDA培养基的配制：40.1g/L马铃薯葡萄糖，2g/L KH₂PO₄，1g/L MgSO₄，8g/L琼脂粉, 0.1g/LVB_1,蒸馏水配调pH至6.5，以备后用。

虫草菌母菌是保存在4℃冰箱中的，从斜面上挑接一块菌落到PDA平板培养基上存放在28℃的恒温箱中培养7天，可使菌种活化。

3.1.4 液体种子培养

种子培养基的配制：20g/L葡萄糖，5g/L酵母膏，5g/L蛋白胨，2g/LKH₂PO₄，1g/LMgSO₄，pH值调到6.5以备后用。此种子培养基装液量为50ml/250ml。

将已在PDA培养基中得到活化的菌落再次挑取少量到液体种子培养基中，在22℃，200转每分钟的摇床中培养5天。

3.1.5 发酵基础培养基

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