论文总字数：20513字

摘 要

由于全球变暖、能源危机受到了全球公众广泛关注，从可再生资源中得到的“生物能源”越来越受到重视。在生物能源中，丁醇作为乙醇之后新一代生物能源具有产生更多能量，腐蚀性小，水溶性小，更易与汽油或柴油混合的特点，因而对丁醇生产的研究受到了广泛关注^[1]。

杨氏工程菌能够在厌氧条件下利用CO/CO₂生成乙酰CoA，粪味菌的丁醇生产途径可以将乙酰CoA转化通过六步反应转化为丁醇。本课题成功地将粪味菌ATCC 25775中丁醇合成途径中分别编码硫解酶（THL）、３-羟基丁酰CoA脱氢酶（HBD）、巴豆酸酶（CRT）、丁酰CoA脱氢酶（BCD）和醛／醇脱氢酶（BDH）的关键基因thil，hbd，crt，bcd-etfB-etfA片段导入到了质粒pIM13中，构建出了多拷贝复制子的杨氏梭菌表达质粒。对质粒的基因测序结果表明，质粒构建成功。

关键词：丁醇 杨氏工程菌 粪味菌

Construction of Butanol Producing Engineered Strain of Clostridium ljungdahlii

Abstract

Due to the global warming and energy security gain global attention, the biofuels produced from renewable resources are got newer attention. Among the biofuels, butanol is currently under the spotlight due to its advantages as a new-generation biofuels over ethanol as it contains more energy, is less corrosive and less water-soluble, and is easier to blend with gasoline or diesel fuels.

In the anaerobic condition, the Clostridium ljungdahlii can produce acetyl-CoA using CO/CO₂, and the butanol pathway in Clostridium scatologenes convert acetyl-CoA into butanol by six steps of reaction. A recombinant butanol pathway composed of genes, thiL, hbd, crt, bcd-etfB-etfA coding for acetyl-CoA acetyltransferase (THL), β-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (HBD), 3-hydroxybutyryl-CoA dehydratase (CRT) and butanol dehydrogenase(BDH), was imported into plasmid pIM13, thus a recombinant plasmid has been constructed. The genome sequencing shows the construction is successful.

Key words: Butanol; Clostridium ljungdahlii; Clostridium scatologenes

目录

第一章 绪论 1

1.1 生物发酵法生产丁醇的应用及市场前景 1

1.2 微生物发酵生产丁醇研究进展 1

1.2.1 概况 1

1.2.2 相关微生物 1

1.2.3 发酵 2

1.2.4 丁醇代谢途径 3

第二章 实验方法 4

2.1 实验材料和试剂 4

2.1.1 实验材料 4

2.1.2 工具酶 4

2.1.3 试剂 5

2.1.4 菌株和质粒 5

2.1.5 培养基及培养方法 6

2.2 实验方法 6

2.2.1 粪味菌基因组的提取 6

2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 7

2.2.3 PCR扩增 7

2.2.4 琼脂糖凝胶/DNA 片段的回收纯化 8

2.2.5 酶切体系 9

2.2.6 连接酶体系 11

2.2.7 质粒提取方法 11

2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 12

2.2.9 大肠杆菌的转化 12

2.2.10 一步克隆 13

2.2.11 plP404复制子序列的查询 14

2.2.12 杨氏梭菌多拷贝表达质粒的构建 14

2.3 本章小结 14

第三章 实验结果 16

3.1 提取基因组DNA 16

3.2 目的片段的PCR扩增和连接 17

3.2.1 上游3片段的PCR扩增 17

3.2.2 下游3片段的PCR扩增 18

3.2.3 ptb CSCA_3689-CSCA_3687的PCR扩增结果 19

3.2.4 pIMP1-six的PCR扩增结果 19

3.3 杨氏梭菌多拷贝表达质粒的构建 21

第四章 结论与展望 22

4.1 结论 22

4.2 展望 22

第一章 绪论

生物发酵法生产丁醇的应用及市场前景

由于全球变暖、能源危机收到了全球公众广泛关注，从可再生资源中得到的“生物能源”越来越受到重视。在生物能源中，丁醇作为乙醇之后新一代生物能源具有产生更多能量，腐蚀性小，水溶性小，更易与汽油或柴油混合的特点，因而对丁醇生产的研究受到了广泛关注^[1]。

据估算，丁醇的年产量在美国市场已达到1300万t^[2]，按照现在的丁醇价格来估算约有90亿美元的产值^[3]。丁醇的目标市场规模以大约每年3%的速度在增长^[4]。丁醇总产量的一半用来合成丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸酯，以制造乳胶表面涂层，搪瓷和油漆。丁醇的其它重要衍生物是丁基乙二醇醚，乙酸丁酯和增塑剂。丁醇在抗生素，维生素和激素的生产中，作为重要的溶剂使用^[5]。而现今使丁醇受到更多关注的用途是作为汽油的替代品或者是燃料添加物。

微生物发酵生产丁醇研究进展

概况

微生物丁醇生产最早由Louis Pasteur在1861年报道，在20世纪早期，通过Chaim Weizmann分离出的产丁醇梭菌工业化^[6]。这种细菌以6:3:1的比例从糖和淀粉中产生丁醇/丙酮/乙醇，该过程被称为丙酮，丁醇，乙醇（ABE）发酵。在1945年，美国三分之二的丁醇通过发酵方法生产。自1960年以后，随着丁醇需求量的增长和石化工业的快速发展，生物学方法迅速被化学合成法取代。近年来，随着原油价格的高涨以及全球变暖问题重视程度的增加，使用生物技术生产丁醇受到了广泛关注，因为丁醇不仅是重要的化工原料，同时也是化石燃料的替代品。

相关微生物

丁醇生产的生物学方法研究至今，主要是由梭状芽胞杆菌属成员进行的^[7]，包括Clostridium acetobutylicum^[8][9][10]，Clostridium beijerincki^[11]，Clostridium pasteurianum，Clostridium saccharoperbutylacetonicum，Clostridium tetanomorphum^[12]，Clostridium saccharoacetobutylicum等。这些产丁醇菌中，丙酮丁醇梭菌ATCC 842^[13]，拜氏梭菌NCIMB 8052^[14]，粪味菌ATCC 25775^[15]全基因序列的分析反映了对丁醇生产发酵过程的积极研究。另外，也有报道将丁醇生产途径相关基因导入Escherichia coli^[16][17]，Saccharomyces cerevisiae^[18]，Lactobacillus mucosae^[19]等微生物进行发酵。

发酵

发酵过程

一般来说，发酵过程需要在有限的营养条件下相对过量的C源中进行，这是获得较高的产率所必须的^[20]。铁元素也是重要的矿物元素添加物，因为丙酮酸盐转化为乙酰CoA需要利用铁硫蛋白^[21]。

在发酵过程中，梭菌容易失去生产丁醇的能力。这种退化现象被发现是因为丙酮丁醇梭菌容易失去大质粒pSOL1，需要在缺乏磷酸盐的环境中，才可以避免该大质粒的丢失^[22]。拜氏梭菌虽然不含有上述质粒，但是同样会出现退化，需要添加乙酸钠来避免退化。

培养基的pH值对于双相丙酮-丁醇发酵生产非常重要。在产酸作用过程中，丙酸和丁酸的大量生成会导致pH值得迅速下降。当pH值小于一个特定值后，产溶剂过程将会开始，酸会被转化，形成丁醇和丙酮。因此，低pH值是产生溶剂的必要条件^[23]。如果pH值很低，在产生足够的酸之前，pH值已经小于4.5，产溶剂过程将会减弱，从而使产率下降。增加培养基中缓冲物质的体积是提高生长量，C源利用率的同时提高丁醇产量最简单的方法^[24]。

根据发酵条件和培养基成分的不同，一个完整的发酵过程需要花费2至6天。最终，通过蒸馏从培养基中分离得到的总的溶剂产量在12g/L到20g/L之间。经典的分批发酵和连续发酵方法在经济效益上都较差，这是溶剂毒性和丙酮-丁醇双相发酵的特性造成的。为了克服这类问题，分批发酵一般需要伴随一个恢复过程，而连续发酵一般采取多步连续发酵的方法^[25]。

发酵底物

丁醇可以使用多种原料进行生产，包括糖蜜，乳清渗透物和玉米等。底物的花费是影响丁醇生产经济效益的重要因素。Jones和Woods对使用不同的发酵底物进行ABE发酵的经济效益做了系统的研究^[26]。

丁醇代谢途径

本课题中利用Clostridium scatologenes的丁醇生产途径进行重组质粒的构建。C. scatologenes中的丁醇代谢途径如下图所示。

acetyl-CoA

acetoacetyl-CoA

beta-hydroxybutyryl-CoA

crotonyl-CoA

butyryl-CoA

thl(CSCA_3690)

hbd(CSCA_3691)

crt(CSCA_3692)

bcd,etfA,etfB(CSCA_3687~3689)

[H]

[H]

butyraldehyde

butanol

bdhA(CSCA_2937)

adhE(CSCA_1267)

图1-1 丁醇代谢途径

Figure 1-1 Butanol pathway existed in C. scatologenes

实验方法

实验材料和试剂

实验材料

表2-1 主要设备及仪器

Table 2-1 Apparatus used in this study

工具酶

表2-2工具酶

Table 2-2 Enzymes used in this study

试剂

表2-3实验试剂

Table 2-3 Chemicals and reagents used in this study

菌株和质粒

表2-4菌株与质粒

Table 2-4 Strains and Plasmids used in this study

培养基及培养方法

培养基

大肠杆菌完全培养基为LB (g/L)：蛋白胨 10，酵母提取物5，氯化钠10。

LB固体培养基(g/L)：蛋白胨 10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂20

所有培养基均经过121℃，20min高温湿热灭菌。

培养方法

大肠杆菌：

菌种活化：在超净台中，取甘油菌在LB固体培养基平板上三区划线，在37 °C恒温培养箱内培养12 h后，挑取单菌落接入种子培养基中。

种子培养：在超净台中，挑取LB固体培养基上活化过的单菌落，接入10 mL LB培养基（50 mL 摇管）中，在摇床上37 °C恒温培养12 h，转速200 rpm。

实验方法

粪味菌基因组的提取

实验室采用基因组试剂盒的方法进行粪味菌基因组的提取。

1. 从平板中挑取单菌落接于2 个含5 mL 液体LB 的摇管中，37℃，200×g，过夜振荡培养。
2. 洗菌：每个摇管加入5ml PBS 缓冲液充分悬浮再次离心弃上清，洗两次。
3. 取细菌培养液1~5ml，分装至5 个灭过菌的1.5ml 离心管，做好标记。12000×g 离心2min，尽量吸净上清。
4. 各加入180ul TE buffer，漩涡混合仪震荡10min，使菌全溶。
5. 取一个灭过菌的1.5ml EP 离心管，配制50mg/ml 的溶菌酶90ul（取4.5mg 的溶菌酶溶于108ul 的Elution Buffer；5ul×5=25ul RNase，取30ul 溶于配溶菌酶的EP 管中）。
6. 每管加入18ul 配制好的溶菌酶和5ul 的RNA 酶，30℃温浴（15~30min）1h，每15min震荡一次。期间称取玻璃珠、溶解蛋白酶K：5 个EP 管，每个称取25mg 玻璃珠；（冰上保存）；称取0.0032g 蛋白酶K 加入125ul 蛋白酶K 储存buffer，充分润洗管壁。
7. 5000 x g 离心5min，倒掉上清，预留10ul 上清。
8. 加入25mg Glass Beads 和200ul Buffer TL，最大速度涡旋10min。静置，使玻璃珠沉于管底，转移上清至灭过菌的1.5ml 离心管（转移上清时要剪枪头）。
9. 加入25ul 蛋白酶K，涡旋10s（或上下颠倒）至混匀。

琼脂糖凝胶电泳

用10×TBE 缓冲液配制0.8％~1.0％琼脂糖凝胶，加热溶解琼脂糖，待冷却至约60℃时，加入染料溴化乙锭，混匀后倒入制胶板中，室温下静置15分钟，使凝胶充分固化。用10×TBE 作为电泳缓冲液，将2ul DNA样品与2ul 10×loading buffer 混合（若DNA 样品加倍，则loading buffer 相应加倍），在190伏恒压下，电泳约20分钟后，取出用凝胶成像仪观察和分析形成的DNA 区带，并保存实验结果。

PCR扩增

PCR扩增上游三片段CSCA_3692-CSCA_3690。

根据其核酸序列设计引物用于扩增基因片段，设计的引物序列如下：

上游引物为：

5’-aaaagggagtgtcgacatatgGAATATAAAAATATTAAAGTAGAAAAAG NdeI

下游引物为：

5’-gtactgagagtgcaccatatgTCTAGATTAGCATCTTTCAACTATTACAGATG NdeI XbaI

取200uL薄管，按表2-5顺序分别加入各试剂。

表2-5 PCR反应液的组成

Table 2-5 PCR reaction system

首先将模板DNA在95℃下变性3min后，再按如下操作30个循环：95℃变性2min，63℃退火30s，72℃延伸3min。循环操作结束后，在72℃下延伸7min，最后降温到4℃保藏。

取少量PCR产物检测扩增效果。

基因片段CSCA_3689-CSCA_3687的PCR扩增

根据其核酸序列设计引物用于扩增基因片段，设计的引物序列如下：

上游引物为：5’-aaaagggagtgtcgacataTGGATTTTACATTGACAAAGGAAC NdeI

下游引物为：5’- gtactgagagtgcaccatatgCTAATTATTTAAAGCTTTTATTTC NdeI

对粪味菌基因组中的基因片段CSCA_3689-CSCA_3687进行PCR扩增。

取200uL薄管，按表2-5顺序分别加入各试剂。

请支付后下载全文，论文总字数：20513字