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摘 要

目前尚没有关于谷氨酸棒状杆菌硫酯酶的研究报道，我们对所推测的具有硫酯酶功能的基因CgI1664进行初步研究，本论文通过对该基因进行失活和回补，结合产物含量分析其功能。本实验通过重叠PCR技术获得△CgI1664基因片段，与pK18mobsacB相连接构建重组质粒pK18mobsacB-△CgI1664，转入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，对基因CgI1664基因进行质粒表达，对重组菌株C. glutamicum NCF-a进行基因回补，构建C. glutamicum NCF-a1，测定生长情况，耗糖量与脂肪酸产量，证实推测基因CgI1664对谷氨酸棒状杆菌合成脂肪酸存在影响。本课题预期为构建高效合成脂肪酸的基因工程菌株提供坚实的理论依据。

关键词：游离脂肪酸 谷氨酸棒状杆菌 硫脂酶 CgI1664

The cloning and integration of thioesterases gene in

Corynebacterium glutamicum

Abstract

There is no research on thioesterases of Corynebacterium glutamicum now, We study the function of CgI1664, this paper use the method of inactivate and anaplerosis, investigated Corynebacterium glutamicum for free fatty acids production preliminary, verify the function of gene CgI1664. Experiment use overlapping PCR knock out target gene, than link with plasmid, build pK18mobsacB-△CgI1664. Recombinant plasmid transform into Corynebacterium glutamicum competent cell build recombination strain C. glutamicum NCF-a. Anplerosising the genes deleted build C. glutamicum NCF-a1. Measuring growth situation、sugar consumption、fatty acid production. Confirmed that gene CgI1664 have effect on Corynebacterium glutamicum product fat acid. expect to lay the foundation for producing fatty acids by genetically modified bacteria efficiently. expect to lay the foundation for producing fatty acids by genetically modified bacteria efficiently. expect to lay the foundation for producing fatty acids by genetically modified bacteria efficiently. This experiment expect to lay the foundation for producing fatty acids by genetically modified bacteria efficiently.

KEYWORDS: Free fatty acids; Corynebacterium glutamicum; Acetyl-CoA carboxylase; Thioesterases；CgI1664

目录

摘要 I

Abstract II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1脂肪酸的性质、应用与市场前景 1

1.1.1脂肪酸的理化性质 1

1.1.2游离脂肪酸的用途 1

1.1.3 游离脂肪酸的市场现状及前景 2

1.2脂肪酸合成的研究进展 3

1.2.1脂肪酸的生物合成方法 3

1.2.2大肠杆菌基因工程改造研究 4

1.2.3谷氨酸棒状杆菌基因工程改造研究 4

1.3本实验研究的意义和实验内容 5

1.3.2本实验的主要内容 5

1.3.1本实验的研究意义 6

第二章 材料与方法 7

2.1实验材料 7

2.1.1菌株与质粒 7

2.1.2实验中用到的引物 8

2.1.3工具酶、分子量标准、试剂盒、试剂、实验仪器 8

2.2 实验方法 11

2.2.1培养基和培养条件 11

2.2.2菌体的生长培养方法 11

2.2.3感受态制备及转化方法 11

2.2.4重组菌株C. glutamicum NCF-a的构建及验证 12

2.2.5重组菌株C. glutamicum NCF-a1的构建及验证 14

2.2.6 分析方法 14

第三章 结果与讨论 16

3.1重组菌株C. glutamicum NCF-a的构建及验证 16

3.2重组菌株C.glutamicum NCF-a1的构建及验证 17

3.3重组菌株C. glutamicum NCF-a发酵产游离脂肪酸研究 18

第四章 结论与展望 21

4.1结论 21

4.2展望 21

参考文献 22

致谢 24

第一章 文献综述

1.1脂肪酸的性质、应用与市场前景

1.1.1脂肪酸的理化性质

脂肪酸是一种重要的平台化合物，广泛应用于医药、食品、工业、保健品等诸多方面，又因脂肪酸的组成与植物油脂相似，其也被称作是“天然汽油”^[1] ，因此脂肪酸作为在生物柴油生产中油脂的原料也成为了一个重要的应用及研究方向。脂肪酸是由碳、氢、氧三种元素组成的一类化合物，是一种由一个末端羧基和一条长的碳链组成的羧酸。脂肪酸是一种有机物，直链饱和脂肪酸的通式是C_（n）H_{（2n 1）}COOH，能与醇作用而生成酯、与碱作用而生成盐，是磷脂、糖脂和中性脂肪等的主要组成成分。一些碳原子数较少的脂肪酸呈无色液体，有刺激性气味，某些碳原子数较多的脂肪酸则是蜡状固体，基本无刺激性气味。脂肪酸是一种最简单的脂，它能组成许多更为复杂的脂类。脂肪酸在有氧的条件下，可氧化分解生成CO₂和H₂O，同时释放出大量的能量，因此脂肪酸也可作为机体供能途径。脂肪酸根据碳链长度的不同可将其分为短链脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFA），中链脂肪酸（Midchain fatty acids，MCFA），长链脂肪酸（Longchain fatty acids，LCFA）。

短链脂肪酸：碳链上的碳原子数小于6为短链脂肪酸，有较强的挥发性；

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