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摘 要

糖苷酶是一类水解各种含糖化合物中的糖苷键生成单糖、寡糖或糖苷类复合物的酶。糖苷类化合物是自然界中一类重要的化合物, 在生物、医药、食品等领域均有着广泛的利用价值。目前天然化合物的应用还存在一些局限，如水溶性差，生物利用度低等。利用葡萄糖苷酶对天然化合物进行糖基化修饰可以显著改善其水溶性差的问题，增加其生物利用度。

本研究对从海栖热袍菌中得到糖苷酶BglB基因，并成功构建了表达载体pET28a-BglB，导入E.coli BL21内部，得到重组菌E.coli BL21/pET28a-BglB，实现了β-糖苷酶在异源宿主大肠杆菌中的表达。将表达的β-糖苷酶用于天然产物天麻苷元和香草醇的糖基化修饰，其活性检测表明β-糖苷酶有一定的合成活性。

本研究实现了糖苷酶BglB的克隆，并实现在大肠杆菌宿主内的表达，且表达的β-糖苷酶具有一定的催化合成天麻苷元和香草醇的活性，或许β-糖苷酶在天然产物的高效的生物合成中有一定的潜力。

关键词: 糖苷酶BglB 海栖热袍菌 克隆表达 β-糖苷酶

Research on Glycosidase enzyme glycosylation of natural products

Abstract

Glycosidases can hydrolyze a variety of glycosidic linkage compounds, including oligosaccharide and glycoside compound. Glycoside compound are important in the nature, which are widely used in biology, pharmacy, food industry and other fields. Currently, there are some limitations on application of natural compounds, such as poor water solubility, low bioavailability, etc. Glucosidases be used in the modification of natural compounds, which can significantly improve its poor water solubility problem, increase its bioavailability.

In this study, we had obtained β-glucosidase BglB gene from marine hot mantle bacteria, Then we construct the recombinate expression vector pET28a-BglB and import it into the E.coli BL2. The recombinate E.coli BL21/pET28a-BglB can produce β-glucosidase, which was used in the glycosylation of tianma aglycone and vanilloid. Activity test assay showed that glucosidase has certain synthetic activity

In this study, we clone and express β-glucosidase BglB gene, and get the recombinate E.coli BL21/pET28a-BglB, which can produce β-glucosidase. The β-glucosidase was successfully used in the glycosylation of tianma aglycone and vanilloid. Glucosidase may has some potential in efficient biosynthesis of natural products.

Key words: Glycosidase BglB Marine hot mantle bacteria Clone and express Gastrodia β-glucosidase

目 录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 糖苷酶简介 1

1.1.1 糖苷酶对天然产物结构改造的作用 1

1.1.2 糖苷酶的作用机制 2

1.2 β葡萄糖苷酶简介 4

1.2.1 β-葡萄糖苷酶的来源及用途 4

1.2.2 β葡萄糖苷酶的研究现状 4

1.3 本课题的研究内容与意义 5

1.3.1 研究内容 5

1.3.2 研究意义 5

第二章 耐有机溶剂β-葡萄糖苷酶产生菌筛选及诱导表达 6

2.1 实验材料 6

2.2.1 实验试剂 6

2.1.2实验仪器 7

2.1.3培养基的配制 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 基因组的提取 8

2.2.2 海栖热袍菌β—葡萄糖苷酶基因的扩增 8

2.2.3 海栖热袍菌β-葡萄糖苷酶基因表达载体的构建 10

2.2.4 β-葡萄糖苷酶BglB在大肠杆菌内的诱导表达 12

2.3 结果与讨论 15

2.3.1 β-葡萄糖苷酶基因的扩增 15

2.3.2 海栖热袍菌β-葡萄糖苷酶基因表达载体的构建 16

2.3.3 β-葡萄糖苷酶BglB在大肠杆菌内的诱导表达 17

2.3.4 酶活检测 18

2.3.5 重组β-葡萄糖苷酶应用于天麻苷元糖基化研究 19

第三章 结论与展望 20

3.1 结论 21

3.2 展望 21

参考文献 22

致 谢 24

第一章 文献综述

1.1 糖苷酶简介

糖苷酶又名糖苷水解酶，几乎存在于所有的生物体中，是一类以内切或外切方式水解各种含糖化合物中的糖苷键生成单糖、寡糖或糖复合物的酶^[5] 。糖基化合物（即糖苷类化合物）是一类重要的天然化合物，具有很多重要的生理功能。主要以单糖、多糖或者皂甙类化合物以及糖蛋白等为存在方式的糖或糖的衍生物，所以其又名配糖体^[6]。糖苷酶作为一类重要的天然化合物，在人类生产、生活各个领域有着广泛的应用，如生物医药研究价值，食品生产价值等等^[7], 也是继核酸、蛋白质之后的又一个广阔的生命与健康的研究领域。

但是目前天然化合物在医药领域的应用还存在一些局限，如水溶性差，生物利用度低等。通过对天然化合物进行结构修饰可以显著改善其水溶差的问题，增加其生物利用度。其中α-淀粉酶，又名液化酶以及β-淀粉酶又名麦芽糖化酶是其发挥作用的主要作用酶^[11]。α-淀粉酶的主要作用是使淀粉、糖元之类多糖中的α-1，4-葡聚糖键水解而成糊精、低聚糖和单糖。β-淀粉酶则是使其水解为β-极限糊精而发挥作用^[6]。根据催化作用机制的不同，糖苷酶可分构型翻转酶和构型保持酶两类。其中，构型保持酶同时具有催化糖苷键水解和转糖基活性的特性，正是其糖苷键合成活性促使其在糖类合成中起着重要作用^[3,4]。

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