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摘 要

丁二酸是一个四碳二元酸，它被广泛应用于可生物降解的聚合物，食品，精细化学品和药品的制备。本研究以一株大肠杆菌丁二酸生产菌为出发菌株，通过电子传递载体传递电子使丁二酸生产菌株发酵葡萄糖生成还原性产物丁二酸。构建一种利用电子的高响应的发酵方法，优化培养基的培养条件，使得更容易发现限制电子的传递的影响因素，有利于后续的实验的进行。通过优化培养基降低发酵的成本，并且加入电子传递载体，检测还原性产物丁二酸的生成，以及丁二酸产生的限制性因素。最后根据实验结果，用合适的发酵培养基验证构建的电子传递链Mtrc对于电子传递的影响。本研究的目标是用电子氧化还原生成大量的还原性NADH，再通过电子的传递调控生成，发酵利用电子提高还原性产物丁二酸的生成。

关键词: 丁二酸 电子传递链 发酵培养

Study on the Pathways of Escherichia Coli Synthesis of Pinosylvin

Abstract

Succinate, a four-carbon dicarboxylate, is widely used in biodegradable polymer, food, fine chemicals and pharmaceuticals. In this study, a strain of Escherichia coli is isolated as the starting strain, and it was ferment in glucose or the transformated of the production of the reduced product by electron transfer. We construct a highly responsive fermentating culture method and optimizing the culture condition of the culture medium, making it easier to find the factors of limiting the transmission of electron, which is beneficial to the subsequent experiment. By optimizing the culture medium to reduce the cost of fermentation, and adding the electron transfer carrier, detecting the formation of the reduction product of succinate, and the limiting factors for the production of succinate. We use appropriate fermentation culture to validate the influence of the construction of electron that transport chain Mtrc. This study is to add the generation of NADH,through the electron transfer regulation of generation, using electronic to increase the yield of the product of succinate.

Key words: Succinate; Fermentation; Electron transfer line

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 丁二酸的介绍 1

1.2 丁二酸的价值 1

1.3 生物合成丁二酸的研究进展 2

1.4 本论文的研究目的和内容 2

第二章 实验材料和方法 3

2.1 实验器材 3

2.2 供试菌株 4

2.3 培养基 4

2.4 质粒转化到大肠杆菌的过程的过程 5

2.5 离心收集菌体的方法 5

2.6 菌体生长测定（以OD600表示）和pH值测定 5

2.7 丁二酸含量测定 5

2.8 通过连接来构建重组表达载体和质粒转化进入受体细胞中 6

2.9 大肠杆菌中质粒的提取 6

2.10 研究高产丁二酸菌株的生长特性 7

2.11 构建一种利用电子的高响应的发酵培养方法 7

2.12 优化培养基成分提高培养还原性产物丁二酸的生成 7

2.13 验证电子传递链构建对于还原性产物生成的影响 7

2.14重组质粒的连接和验证 8

第三章 实验结果和讨论 9

3.1 研究高产丁二酸菌株的生长特性 9

3.2 构建一种利用电子的高响应的发酵培养方法 10

3.3 优化培养基成分提高培养还原性产物丁二酸的生成 12

3.4 验证电子传递链构建对于还原性产物生成的影响 15

3.5 重组质粒的连接和验证 17

第四章 结论与展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献 20

致 谢 21

第一章 文献综述

1.1 丁二酸的介绍

琥珀酸，学名丁二酸，是一种常见的天然有机酸,广泛存在于人体、动物、植物和微生物中^[1]。丁二酸是一种重要的“C4 平台化合物”，广泛应用于食品、医药、农业领域，可作为合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮及可降解生物高分子材料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等化合物的原料，具有广阔的应用前景^[2-3]。丁二酸是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物，广泛的应用于生物高分子、食品与医药等行业，市场潜在需求量巨大^[4]。

丁二酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中介物^[5]。一般丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌能够分泌琥珀酸。

一些专性或兼性厌氧菌数是实际的丁二酸生产者，包括厌氧发酵产琥珀酸^[6] ，产琥珀酸放线杆菌^[7]、溶血曼海姆琥珀酸菌^[8]和谷氨酸棒状杆菌^[9]。在厌氧条件下，在替代的电子受体缺失的情况下，大肠杆菌将糖转化为发酵产物的混合物，积累乳酸、醋酸、甲酸、乙醇和一个较小程度的琥珀酸^[10]。在实验室中，琥珀酸可用两分子丙二酸二乙酯的钠盐与碘反应，继而水解脱羧制得。琥珀酸的重要用途是制备五元杂环化合物，例如，琥珀酸受热迅速失水，形成琥珀酸酐，它是呋喃环系化合物。琥珀酸酐是制造药物、染料和醇酸树脂的重要原料。

1.2 丁二酸的价值

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