论文总字数：28733字

摘 要

CDK4目前已经成为治疗恶性肿瘤的一个具有吸引力的靶标，并且有一些药物已经成为有效的CDK4抑制剂。然而，要提高蛋白激酶之间尤其是其与CDKs之间的选择性仍然是一个具有挑战性的任务。在这里，我们使用了序列比对，分子对接，分子动力学模拟，自由能计算和自由能分解分析来揭示能使嘧啶类抑制剂选择性地抑制CDK4。对接和分子动力学模拟结果表明所有药物的结合模式是相似的，都位于CDK2或者CDK4的ATP结合区域。能量分析表明计算的结合能与抑制剂的实验抑制常数一致；范德华作用(ΔE_vdw)在整个能量贡献中起主导作用，其中范德华对于区分CDK2药物的结合亲和性是很重要的，而静电能对于区分CDK4的结合亲和性很重要。静电能是药物选择性抑制CDK4的关键原因之一。本文工作为理性设计CDK2/CDK4抑制剂提供了基础数据和理论指导。

关键词：细胞周期素依赖性激酶-2 细胞周期素依赖性激酶-4 嘧啶类抑制剂 分子动力学模拟

Selective theory research of 4-(Pyrazol-4-yl)-pyrimidines for CDK2 / CDK4

Abstract

CDK4 has emerged as an attractive target for the treatment of tumors and several drugs have been reported to be effective inhibitors of CDK4. However, it is still a challenging task to improve selectivity among protein kinases, especially CDKs. Here, we used the sequence alignment, molecular docking, molecular dynamic simulations, free-energy calculations and free-energy decomposition analysis to reveal the mechanism that enables the primidine derivative inhibitors to selectively inhibit CDK4. Docking and MD results demonstrate that the binding modes of all inhibitors are similar and they all locate in the ATP binding pocket of CDK2 or CDK4. The energy analysis indicate that the the total binding free energy is consistent with experimental inhibitory constants(IC50) and the van der Waals energy term (ΔE_vdw) contributes dominantly in the total binding free energy (ΔG_bind). The van der Waals energy term is mainly responsible for differentiating the binding affinity of the two inhibitors with CDK2, while, for the binding affinity of CDK4/inhibitors, is the electrastatic energy term. At the same time, importantly, the electrastatic energy between drugs and key residues also play an important role in recognizing the selectivity towards CDK4. The current work may be helpful for the future design of novel selective CDK2 or CDK4 inhibitors.

Key Words: Cyclin-dependent kinase 2; Cyclin-dependent kinase 4; Alosines inhibitors; Molecular dynamics simulation

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1两种蛋白质的简介 1

1.1.1细胞周期依赖性蛋白激酶-2 1

1.1.2细胞周期依赖性蛋白激酶-4 3

1.2药物的选择性 4

1.3前人的研究工作 5

1.4本文的工作 6

第二章 计算方法 8

2.1 分子对接 8

2.2 分子动力学模拟 8

2.3 结合自由能计算 9

2.4 本文的计算细节 9

2.4.1初始结构和同源建模 9

2.4.2分子对接 10

2.4.3序列比对 11

2.4.4分子动力学模拟 11

2.4.5自由能计算 11

第三章 结果与讨论 13

3.1 体系的稳定性和柔性 15

3.2 药物与CDK2及CDK4的结合模式 16

3.3 药物的生物活性 21

3.4 药物的选择性机理 23

第四章 结论 24

参考文献 25

致 谢 29

第一章 绪论

癌症在人口死亡原因中排名第二，仅次于心脏病，是严重危害人类健康的常见病，世界卫生组织近日发表了一份《世界癌症报告》，综合分析了全球癌症的现状以及发展趋势，预测全球癌症发病率有猛增的危险。根据目前癌症的发病趋势判断，今后数年将是全球癌症的高发年份，预计到2020年全世界癌症发病率将增加50％，每年将新增约1500万个癌症病例。目前全球各国已批准上市的抗癌药物大约有130~150种，用这些药物配制成的各种抗癌药物制剂大约有1300~1500种，但传统的抗癌药物大多属于细胞毒性药物，对正常细胞存在毒副作用，其临床疗效的好坏往往取决于癌细胞对药物的敏感性，不良反应较大，且长期用药后易出现耐药性。近些年，随着分子生物学和基因工程的迅速发展，大量的实验和临床证实癌症可能是由于在细胞分裂的不同阶段受各种因素的影响，导致细胞出现分化和增殖的异常，从而危及机体的安全。而细胞周期的内源性调控主要是通过磷酸化和去磷酸化为基础的周期素(cyclin)-周期素依赖激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)-CDK抑制剂的途径实现的，CDK基因及其表达产物的异常可使细胞呈自主、无限制地增殖，从而导致肿瘤产生^[1-3]。因而，细胞周期依赖性蛋白激酶-2（CDK4）和细胞周期依赖性蛋白激酶-4（CDK4）成为人们关注和研究的焦点。

1.1两种蛋白质的简介

1.1.1细胞周期依赖性蛋白激酶-2

CDK家族有一个明星成员“CDK2”,在PDB数据库中就有300多个CDK2单体或与各种抑制剂结合的晶体结构，超过了其它CDK成员结晶数量的总和。CDK2引起这么大的关注可能与其和癌症的密切关系有关^[4-6]。如前所述，CDK2单体没有活性，需要在细胞周期内特定的时间点与相应的细胞周期素结合才能被激活^[7]CDK2与细胞周期素E的复合物负责调控G1/S过渡阶段，会引起对pRb的进一步磷酸化，释放出更多的转录因子。细胞周期素A在Gl/S过渡阶段开始富集；在S期与CDK2结合，这使复合物促进细胞顺利通过S期；在S/G2过渡阶段，CDK2与细胞周期素A的复合物的活性也会促进不同底物的磷酸化，从而引起DNA复制并使G1转录因子失活。

CDK2单体(PDB ID：lFIN)由298个氨基酸组成，在空间中跟经典的蛋白激酶一样，叠合成一个典型的双叶形结构^[8]。主要包含一个相对较小的氮端，和相对较大的碳端。氮端包含氨基酸1-85，主要是一个反平行的五股β-折叠和一个主要的C-螺旋结构。碳端主要由α-螺旋结构组成。单肽链(氨基酸81-83)作为一个枢纽区(或者称为铰链区)连接着碳端和氮端，保证两个末端能够自由的旋转，并且不破坏彼此的二级结构。CDK2单体的结构在图1.1中展示出来。在碳端域中包含的重要的片段有负责促进磷酸化作用的催化位点，包含位于保守的DFG(氨基酸145—147)和APE(氨基酸170—172)控制点之间氨基酸片段的活化片段，和位于活化片段中的磷酸化位点Thr160^[9]。在无活性的CDK2单体中，位于活化片段间的Thr160位点面对着富甘氨酸环。而巨大的T环位于催化空腔的入口处，它能阻止多肽底物进入催化位点与ATP发生作用。详细来讲，位于催化位点内，嵌入在PSTAIRE螺旋片段(氨基酸45-51)的氨基酸Glu51的侧链是朝向催化空腔外部的。位于催化空腔内的精氨酸，尤其是预测的多肽底物作用位点，对ATP的三磷酸基团的结合也十分重要。CDK家族独有的序列便是包含在氮端C-螺旋结构中的PSTAIRE片段，它在蛋白质表面有十分重要的作用。CDK2固有的柔韧性以及与细胞周期素的结合使它能够在自己的多个空腔中容纳各种各样的抑制剂。

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