论文总字数：20227字

摘 要

近年来，稀有单糖在食品、保健、医药等领域的诸多应用，引起人们越来越多的关注。例如它们作为低热量的甜味剂的使用，以及膨化剂、抗氧化剂、糖苷酶抑制剂、核苷类似物等。大多数糖异构酶是来转换单糖的，但是糖异构酶本身能高效的生成各种各样的单糖。近日，磷酸糖异构酶作为一种产各种单糖的酶被提及，因为它们不仅能转化原本的磷酸糖底物，而且能转换与它有相同配置结构的底物糖。

因此，我们提出利用6-磷酸甘露糖异构酶作为一种单糖转换工具来催化6-磷酸果糖和6-磷酸甘露糖之间的相互转换。6-磷酸甘露糖异构酶将羟基在C-2和C-3同一方向的醛糖基异构化，如D-型和L-型核糖，塔罗糖，来苏糖，甘露糖和阿落糖等。

本实验克隆了一组来自Bacillus subtilis的基因编码6-磷酸甘露糖异构酶，并在Escherichia coli中得到表达。研究了它的底物特异性和对L-核糖的生物转化性能。

关键词: 稀有糖 甘露糖-6-磷酸异构酶 L-核糖

Abstract

Recently, rare monosaccharides have attracted much attention in the food, nutritional, and pharmaceutical industries due to their many applications, including their use as low-calorie sweeteners, bulking agents, antioxidants, glycosidase inhibitors, and nucleoside analogs. Many sugar isomerases that convert monosaccharides have been characterized.However, sugar isomerases themselves are sufficient to produce various types of monosaccharides more efficiently. Recently, sugar phosphate isomerases have been suggested as useful enzymes for producing various monosaccharides because they convert not only the authentic substrate sugar phosphate but also the substrate sugar that have a similar configuration.

Thus, we have proposed the use of mannose-6-phosphate isomerase, which catalyzes the interconversion of mannose 6-phosphate and fructose 6-phosphate, as a tool to convert monosaccharides. MPI( mannose-6-phosphate isomerase) isomerizes aldose substrates possessing hydroxyl groups oriented in the same direction at the C2 and C3 positions such as the D- and L-forms of ribose, lyxose, talose, mannose, and allose.
In this study, a gene encoding mannose-6-phosphate isomerase from Bacillus subtilis was cloned and expressed in Escherichia coli. Its substrate specificity and bioconversions of L-ribose were investigated

Key words: rare monosaccharides; mannose-6-phosphate isomerase; L-ribose

目 录

摘 要 II

Abstract III

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 稀有单糖简介 1

1.3 L-核糖的生理功能及医药应用 1

1.3.1 生理功能 1

1.3.2 医药应用 2

1.4 L-核糖的制备 2

1.4.1化学合成法 2

1.4.2 由糖类物质生物转化制备L-核糖 2

1.4.3生物转化的催化酶 3

1.5 课题展望 3

第二章 实验材料与方法 4

2.1 实验材料 4

2.1.1 菌株与质粒 4

2.1.2 实验仪器及试剂 4

2.1.3 培养基，培养条件，基因组提取及质粒提取 5

2.1.4 PCR反应 5

2.1.5 目的片段manA与载体质粒pET28a( )连接并转化 6

2.1.6 MPI酶活检测 6

2.1.7 重组蛋白诱导表达后SDS-PAGE检测、纯化及酶活初测 8

第三章 结果与讨论 10

3.1 B.subtilis甘露糖-6-磷酸异构酶氨基酸序列比对 10

3.2 BS MPI分子量测定 10

3.3 金属离子、pH、温度对BS MPI的影响 10

3.4 B.subtilis甘露糖-6-磷酸异构酶的底物特异性 11

3.5 BS MPI反应平衡比 13

3.6 BS MPI催化制备L-核糖 14

第四章 结论与展望 18

4.1 结论 18

4.2 展望 18

参考文献 19

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1 引言

磷酸甘露糖异构酶（Phosphomannose isomerase，PMI ）可逆催化生物体内甘露糖-6-磷酸（M-6-P）和果糖-6-磷酸（F-6-P）之间的互相转化，MPI是一种依赖金属离子的金属酶^[1]。

随着基因工程技术的迅猛发展，利用分子克隆以及外源表达技术可以大幅度地提升某种工业酶在宿主微生物中的表达量，通过这种方法构建的基因工程菌株具有一般微生物很难企及的酶催化效率；运用共表达基因重组菌生产L-核糖的工艺在国内还没有报道，本实验选择自筛的发酵乳杆菌和嗜热栖热菌作为分子生物学研究的出发菌株，通过PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到L-阿拉伯糖异构酶的编码基因araA和甘露糖-6-磷酸异构酶(PMI) 的编码基因manA，利用大肠杆菌作为宿主，成功构建了能够高效共表达L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌。

1.2 稀有单糖简介

稀有单糖，是―类在自然界中存在但是含量极其稀少的单糖及其相应的衍生物^[2]。稀有单糖同样作为一种糖类，在长期的制糖工业中渐渐为人们所重视，主要原因是随着人类生活水平的提高，各种食品甜品及饮品类食物中，糖的添加量逐渐增加，以满足人们口感上对甜味的需求，但却同时引发肥胖、糖尿病等健康问题^[3]。近几年来木糖醇的研究及应用，代替了传统的甜味剂，且木糖醇作为一种稀有单糖类物质，对人体还有其他的益处，最能为人熟悉的是它具有防龋齿的生理功能^[4]。已经研究发现的稀有糖大概有30来种，其中L-型和D-型比例各占一半，多数稀有单糖的研究仍没有很清晰，例如L-核糖，L-来苏糖等都属于稀有单糖^[5].

1.3 L-核糖的生理功能及医药应用

1.3.1 生理功能

L-核糖作为一种重要的医药中间体，能合成各种L-核糖衍生物，有着重要的医学应用价值^[6]，近年来，L-核糖应用到医药工业的研究正在逐步开展。

临床医学已经证实，利用L-核糖替代D-核糖导入生物机体内，在细胞内合成L-核糖核酸^[7]。其作用表现在，异常细胞的繁殖能力较正常细胞旺盛，但是它们的识别能力较正常细胞差，L-核糖核酸能被异常细胞利用使得繁殖细胞在转录时遗传信息发生错误信号，进而起到抗癌和抗病毒的作用，L-核糖的良好抗病毒生理功能及对正常细胞毒副作用小的优点使其能很好应用于医药治疗过程^[8]。

1.3.2 医药应用

L-核糖的医药应用着重表现在它作为一种重要的起始物合成一系列L-核糖衍生物，并应用于抗病毒方面。

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