论文总字数：16326字

摘 要

本文主要利用对乳酸菌合成胞外多糖的含量来检测添加感应因子AI-2对保加利亚乳杆菌和乳酸链球菌生长情况的影响。将乳酸菌不同时间点不同体积的上清分别加入各自对应的菌培养液中，根据已知保加利亚乳杆菌和乳酸链球菌最适宜的的生长情况来选取合适条件下的菌株进行发酵检测不同起始发酵条件下多糖的含量。通过用分光光度计检测，加入上清的乳酸菌的胞外多糖含量明显高于没有加过上清的乳酸菌的胞外多糖含量。在初始pH值为6.5、接种量为1.0%发酵温度为37 ℃以及发酵时间为28h的条件下添加自身上清的乳酸量球菌比未添加的EPS含量高26mg/L；当初始PH为6.5、发酵温度为37℃、发酵时间为28h以及接种量为2.0%时加入上清的保加利亚乳杆菌的EPS含量高于未加上清的保加利亚乳杆菌14.43mg/L。 并且发酵培养条件的不同对乳酸菌胞外多糖的含量也有很大影响。

关键词： 保加利亚乳杆菌 乳酸链球菌 群体感应 信号分子AI-2 胞外多糖

Effect of quorum sensing factor on the synthesis of extracellular polysaccharide in Lactobacillus Fermentation

ABSTRACT

In this paper, the effects of AI-2 on the growth of bulgaricus Lactobacillus and Streptococcus lactate were detected by using the contents of the extracellular polysaccharide of Lactobacillus.Will lactic acid bacteria at different time point with different volume of supernatant were added to the respective bacteria culture liquid, according to the known bulgaricus Lactobacillus and Streptococcus lactis is the most suitable for the growth of to select the suitable conditions of strain content of polysaccharide in fermentation detection of different initial fermentation conditions.By spectrophotometer detection, the extracellular polysaccharide of content Lactic acid bacteria added to the supernatant were significantly higher than those extracellular polysaccharide of content Lactic acid bacteria without the supernatant.In the initial pH value of 6.5, 1.0% inoculum fermentation temperature at 37 ℃ and fermentation time for 28h added under its own amount of lactic acid bacteria than supernatant was not added EPS content 26mg / L.When the initial PH value of 6.5, fermentation temperature at 37 ℃, fermentation time was for 28h and inoculation was added at levels of 2.0% EPS supernatant of bulgaricus Lactobacillus higher than plus clear 14.43mg / L.And different fermentation conditions also have a significant impact on the content of lactic acid Exopolysaccharide.

Key words: Bulgaria Lactobacillus;Streptococcus lactis;quorum-sensing;Autoinducer-2;

Exopolysaccharides

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1研究背景 1

1.2群体感应 2

1.2.1群体感应的分类 2

1.2.2群体感应信号分子的检测 3

1.3乳酸菌群体感应 3

1.3.1 乳酸菌群体感应信号分子的分类 3

1.3.2乳酸菌群体感应研究现状 4

1.4 胞外多糖 4

1.4.1胞外多糖的概述 4

1.4.2 菌种对胞外多糖的影响 5

1.4.3发酵过程及条件对EPS含量的影响 5

第二章 实验部分 6

2.1 材料与设备 6

2.1.1菌种及培养基 6

2.1.2主要试剂 6

2.1.3 主要仪器与设备 7

2.2实验操作方法 7

2.2.1保加利亚乳杆菌的活化、种子液以及稀释液的制备方法 7

2.2.2乳酸链球菌的活化、种子液以及稀释液的制备方法 7

2.2.3不同上清液的制备方法 8

2.2.4透析袋的活化方法 8

2.2.5发酵液的制备 8

2.2.6胞外多糖的测定 9

2.2.7 发酵过程中条件的改变对EPS含量的影响 9

2.2.8 菌株对EPS含量的影响 10

2.3 数据处理 10

2.4 结果与讨论 10

2.4.1葡萄糖标准曲线的制作 10

2.4.2 发酵过程及条件对乳酸链球菌EPS含量的影响 11

2.4.3 发酵过程及条件对保加利亚乳杆菌EPS含量的影响 13

3.1结论 16

3.2展望 16

参考文献 18

致 谢 20

第一章 文献综述

1.1研究背景

乳酸菌(lactic acid bacteria，简称LAB)是指一类以糖（如葡萄糖等）为营养元素发酵产生乳酸、蛋白质等物质，但不产生腐败产物，不能形成芽孢，运动性低，裂殖生为生殖方式，革兰氏染色呈阳性，过氧化氢阴性的细菌总称。共有9个属：乳酸杆菌属、明串珠菌属 、孢子乳酸菌属、肉食杆菌属、双歧杆菌属、乳酸球菌属、链球菌属、迷走球菌属以及片球菌属。前4个属呈杆状，后5个属呈球状。因乳酸菌发酵过程中会产生较多的有机酸、醇类及各种氨基酸等代谢产物，具有一定抑制腐败菌等作用，以及维持肠道菌群的微生态平衡，提高人体消化能力；改善制品风味；提高营养的利用率、促进营养充分吸收；增强机体免疫功能；预防和抑制肿瘤发生；控制内毒素产生、降低胆固醇含量；延缓机体衰老等对人畜机体保健有益的生理功效。 根据加工工艺不同可将乳酸发酵果蔬制品 ，可用于发酵果蔬食品的乳酸菌主要有植乳杆菌、嗜酸乳杆菌、肠膜明串珠菌。在发酵肉制品中，由于蛋白质的分解，会在发酵过程中产生一系列风味物质，使制品的营养价值和风味都得到改善，发酵肉制品生产中大多数采用啤酒片球菌和植物杆菌的单一菌种或两种的混合物。乳酸菌也可用于酿造酒类 ，产生的乳酸与乙醇醋化，生乳酸乙醋，以此提高白酒的质量，改善葡萄酒的风味。乳酸菌是目前世界上公认安 全的食品级微生物且是一种广泛应用于食品工业生产的革兰氏阳性细菌，其已广泛应用于乳制品、肉制品、蔬菜制品、饮料等一系列食品中，故在食品工业尤其是发酵产品中发挥着重要作用，与人们的生活的关系有十分密切的联系^[1-4]。

利用乳酸菌进行发酵的过程中，PH值、胞外多糖含量、温度、菌种种类以及比例、时间、浓度、培养基构成 等生长因子通过对其的影响从而影响产品的品质和风味，因此对于乳酸菌发酵的影响因素的研究对开发优质产品具有重要意义。目前关于乳酸菌发酵的研究多集中于菌种改造以及各项物理因子的影响，而对于微生物之间的群体感应研究较少，群体感应( quorum sensing, 简称QS)是乳酸菌与外界环境进行信息交流的调控系统，尤其是与细菌素合成有关的QS机制,因此对它的研究有助于构建食品级基因表达系统并解释发酵调控机理，因此对乳酸菌的群体感应调控研究具有巨大的潜在工业应用价值和学术价值。

1.2群体感应

H astings JW等^[5-6]于1977年在一种海洋发光细菌 Vibrio fischeri中首次发现并描述了群体感应 ( quorum sensing, 简称QS)现象，QS是细菌根据种群密度大小进行胞内或者胞间信息传递,调节群体行为和调控基因表达的一种机制，它利用可在细胞间扩散的信号分子—自体诱导物(autoinducer，简称AI)来感知菌群的密度变化,在信号分子达到一定阈值时将启动其相关的基因表达，调控与之相关生物学功能，如生物发光、生物群浮游现象、抗菌肤及胞外多糖的合成、抗生素的生物合成、根瘤菌与植物共生、毒素因子及 细菌素的产生、稳定期的进人、细菌群集、Ti质粒的接合转移、孢子和生物被膜的形成等^[26]。

1.2.1群体感应的分类

根据细菌的革兰氏染色特性、信号分子以及群体感应机制的差异性，常见的QS系统可分为四种具有代表性的类型：1、酰基高丝氨酸环内酯类(acyl－ho-moserine lactone，简称AHL)为信号分子的LuxI /LuxR QS信号系统，即AI－1信号分子，其存在于多数革兰氏阴性菌中；2、以寡肽（oligopeptides）类似物作为信号分子的革兰氏阳性菌的QS系统；3、扩散信号因子（ diffusible signal factor，简称DSF）；4、信号分子AI－2，其合成主要依赖于 LuxS 基因编码的 LuxS 蛋白酶，在革兰氏阳性菌与阴性菌中共同存在，并且由于 AI－2 必须由luxS 基因编码的蛋白酶催化合成，故luxS 基因被认为是AI－2信号分子合成的标志性基因^[9]。其中AI-2 分子结构、功能均不同于传统的 AI 分子，是近年来新发现的一种介导细菌种间信号传导的自体诱导分子。AI－2的受体是外周胞质蛋白LuxP ^[11]。目前，已经在许多细菌的生长中发现了AI-2系统，其中哈维氏氏弧菌能产生 2 种自身诱导分子，即AI－1 和 AI－2。在高细胞密度的情况下，信号分子通过自由扩散进入细胞，当信号分子在细胞内达到一个特定的浓度阈值后，与胞内的信号分子接收器 LuxR 蛋白结合，并与启动子区和 RNA 聚合酶相互作用，启动相关的基因表达，激活荧光操纵子的转录和生物荧光的产生^[12]。

1.2.2群体感应信号分子的检测

群体感应信号分子对于研究微生物群体感应具有重要的意义，微生物通过其改变或者做出不同的群体生长特征，从而使其对外界做出相应的群体反应，而不仅仅是一个单独的主体对外界做出反应，使得微生物之间具有信息的交互传递，从而种群间得以获得更好的应变能力，最终使其能够更好的适应环境。这相当于赋予了单细胞生物一些高等生物的特性, 因此QS系统有可能就是单细胞生物向多细胞生物进化的早期步骤^[13]，对其的研究在生物、种族进化以及发酵等方面都具有重要的意义，并为许多领域进一步的科研提供理论基础。目前，其检测方法主要可以分为生物法与物理法^[15]。

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