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摘 要

利那洛肽是一种由14个氨基酸残基组成并包含3对二硫键的多肽药物，其生成关键在于3对二硫键的氧化，自由巯基经氧化剂氧化两两配对，有多种同分异构体存在的可能。

本课题经多种实验文献参考以及考虑到多肽本身的构象问题，最终选择一步液相氧化方法。通过相同浓度的线性利那洛肽在不同的缓冲盐氧化体系中的氧化过程比较，检测确定缓冲盐体系A为最适氧化体系。再由不同浓度的线性利那洛肽在缓冲液A中的氧化反应，经检测确定0.5mg/ml为最适反应浓度。最后经HPLC确定目标肽的出峰位置，并对其进行初步分析，通过制备型HPLC分离纯化后对其进行结构分析确证了二硫键位置。

关键词：液相氧化 利那洛肽 HPLC 分离纯化

Cyclization reaction and liquid phase analysis of a bioactive cyclic-peptide

Abstract

Linaclotide is a peptide drugs composed by 14 amino acid residues and contains three disulfide bonds. The key generation is linaclotide oxidation of three pairs of disulfide bonds, for the free sulfhydryl paired off groups by the oxidizing agent may exist a variety of isomers.

By a variety of experimental literature references and taking into account the polypeptide conformation problem itself, finally we select step oxidation - liquid-phase oxidation, for the subject. By comparing the linear, the same concentration of los peptide oxidation in different buffer salt oxidation system, tested to determine the buffer salt system A is the optimal oxidation system. By different concentrations of linear again, the peptide in the buffer salt oxidation reaction in A, via detecting concentration of 0.5 mg/ml for optimum. We choose the targeting peptide By HPLC in experiments, preliminary analysis, and confirm its final structure after separation and purification.

Key Words: Liquid-phase oxidation; linaclotide; HPLC; purification

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1. 环肽的合成方法 1

1.1.1 一步氧化法 1

1.1.2 分步氧化法 2

1.1.3. 新的环肽形成方法 2

1.2. 利那洛肽 3

1.2.1. 简介 3

1.2.2. 结构 3

1.3. 合成利那洛肽的研究进展 4

1.4. 研究目的与内容 5

1.4.1. 研究目的 5

1.4.2. 研究内容 5

第二章 实验过程 7

2.1. 前言 7

2.2. 试剂与仪器 7

2.2.1. 试剂 7

2.2.2. 仪器 7

2.3. 实验方法 7

2.3.1. 多种液相氧化成环方法的比较 7

2.3.2. 环肽的分析方法 9

2.3.4. 利那洛肽的制备 9

2.3.5. 制备后分析 10

第三章 实验结果与讨论 11

3.1. 实验结果 11

3.1.1. 不同成环反应HPLC检测对比图 11

3.1.2 缓冲液A氧化HPLC检测结果 12

3.1.3. 利那洛肽的HPLC检测 14

3.1.4 对环肽的初步制备 14

3.1.5. 制备后分析 15

3.2. 讨论 16

3.3. 小结 16

第四章 结论与展望 16

4.1. 结论 16

4.2. 展望 17

参考文献 19

致谢 21

第一章 文献综述

简单来说，形成酰胺键的一类化合物，都可称作是肽类化合物^[1]。具体的说，肽类化合物是一类以肽键形成的多聚氨基酸化合物。我们根据多肽的结构又可分为直链肽和环肽。环肽与直链肽相比，更具稳定性、生物利用度更高，有多种生理功能和药用价值，其广泛存在于自然界生物体中^[2]。鉴于环肽的诸多优点，近年来已成为多肽研究的新热点。本文主要研究含二硫键的多肽利那洛肽的环化方法。

1.1 环肽的合成方法

环肽的合成方法有很多，二硫键的正确形成往往是合成的关键^[3]。

形成二硫键的实质其实就是两个游离的巯基经氧化后形成S-S共价键^[4]。从化学反应机理上来讲，这是一个自由基反应。然而在多肽合成中，二硫键的形成非常复杂。由于多肽分子量较大，空间结构复杂，半胱氨酸的巯基非常活泼，容易发生副反应，多肽分子中的某些残基易被氧化或修饰^[5]。因此，其反应机理较为复杂，即可能是游离基反应，也可能是离子反应。

二硫键的氧化成环是含多个二硫键的多肽中最重要的部分。如何正确的成环以及正确的连接二硫键的位置的该课题的关键。下面介绍该技术目前所采用的方法。

1.1.1 一步氧化法

选择合适的氧化条件可以一步氧化形成两对或是多对二硫键的正确配对结构，是合成天然多肽最为常用的方式。因为氧化产物多为具有热稳定性的构象，氧化产率也较高，如一些含有二至三对的天然芋螺毒素就是采用该方法^[6]合成。Tam等^[7]采用20%的DMSO水溶液氧化形成了defensin分子内的三对二硫键，得到了与天然构象相同活性的defensin(总产率为14%)。一步氧化法虽然简便，但往往难以保证形成二硫键的正确配对。

1.1.2 分步氧化法

在合成一些天然肽的多变体时，考虑到产物构象的热稳定性，一步氧化产率太低，这时就可采用两组或多组不同的巯基保护基，利用其性质的差异，分步氧化两对或多对二硫键^[8]。如某肽链中结构有四个半胱氨酸，需分别在1、15位和3、11位之间形成两对二硫键。这时，可在1、15位选用Cys(Acm)，在3、11位选用Cys(4-MeBzl)。首先用HF脱保护，游离出3、11位的半胱氨酸巯基，以铁氰化钾氧化形成3、11位二硫键，然后采用碘氧化形成1、15位的二硫键。Tamamura等^[9]采用空气氧化法和二甲亚砜氧化法成功地合成了含有两对分子内二硫键的Tachyplesin-I。Akaji等^[10]采用空气氧化法、碘氧化法和氯硅烷-亚砜氧化法合成了含三对二硫键的人胰岛素。需特别说明的是，含两对二硫键的多肽，采用空气氧化法，不加氧化还原催化剂便可达到较高产率，但含三对及三对以上二硫键的多肽，必须加氧化还原催化剂，如还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽，半胱氨酸-胱氨酸，巯基苏糖醇等^[11]，才能达到较高的产率。

1.1.3 新的环肽形成方法

近年来，空气氧化法、铁氰化钾氧化法和碘氧化法依然是多肽合成应用最广泛的经典方法。但DMSO氧化法、三氟乙酸铊氧化法和Npys氧化法等新方法逐渐被应用的越来越多。而氰化碘氧化法、NIS氧化法及锍盐氧化法等尚处于研究探索之中，在多肽的应用合成中并不多见^[12]。

二硫键的形成一直是多肽合成中的一个难点，目前尚无一种既简便又各方面都令人满意的方法。但根据合成肽的序列特点，在众多的方法中，总能选择出一种或几种较为满意的方法来形成二硫键结构。

1.2 利那洛肽

1.2.1 简介

利那洛肽是一种鸟苷酸环化酶C激动剂，由美国Ironwood公司研发，于2012年8月30日获美国FDA批准上市，商品名为Linzess^[13]。该药为胶囊剂，用于治疗便秘肠易激综合症(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)，它是首个具有此种作用机制的治疗便秘的药物^[14]。

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