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摘 要

利那洛肽是一种鸟苷酸环化酶-C（GCC）受体激动剂，主要用于治疗便秘型肠易激综合征（IBS-C），全球IBS患者中有1/3患者属于IBS-C类型，极大地影响了患者的生活质量，且给社会带来了巨大的负担。利那洛肽自2012年经美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市后给患者带来了新的希望。

利那洛肽是一个由14个氨基酸残基组成并包含3对二硫键的多肽药物。本课题主要是将固相合成得到的线性利那洛肽粗品通过HPLC方法，建立线性利那洛肽的纯度分析方法，经制备型HPLC纯化。

本课题采用HPLC方法，对固相合成线性利那洛肽粗品进行纯化和分析，最终得到较高纯度98.69% 和较低纯度89.27% 的线性利那洛肽，处理批次的平均所得率为24.69%。

关键词：肠易激综合征 线性利那洛肽 纯化 高效液相色谱

ABSTRACT

Linaclotide is a guanylate cyclase-C (GCC) agonists, which is mainly used for treating constipation type of irritable bowel syndrome (IBS-C) .One third of IBS patients are IBS-C around the world, they have had influenced in the quality of patients′ life greatly, and give a large burden on the society. However, the linaclotide have brought expectation for patients since approved by the FDA in 2012.

Linaclotide is a polypeptide drugs composed by 14 amino acid residues and contains three disulfide bonds.The linear peptide is purifiedfrom crude peptide by P-HPLC to be oxidized to linaclotide.

Purified and analyzed solid phase synthesis of linear linaclotide crude product by using HPLC ,finally we obtained high purity of 98.69% and low purity of 89.27% linear linaclotide.The average income of batch processing rate is 24.69%.

Key Words: IBS-C；Linear linaclotide；Purification；HPLC

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1利那洛肽相关简介 1

1.2色谱技术分离多肽及研究进展 1

1.2.1高效液相色谱(HPLC) 1

1.2.2离子交换色谱(IEXC) 2

1.2.3反相高效液相色谱(RP-HPLC) 2

1.2.4疏水作用色谱(HIC) 2

1.2.5分子排阻色谱 (SEC) 3

1.3层析技术分离多肽及其研究进展 3

1.3.1亲和层析(AC) 3

1.3.2毛细管电泳(CE) 3

1.3.3毛细管区带电泳( CZE) 3

1.3.4胶束电动毛细管电泳( MEEC) 3

1.3.5毛细管凝胶电泳( CGE) 4

1.4本论文的实验目的 4

第二章 实验方法 5

2.1 试剂与仪器 5

2.1.1 试剂 5

2.1.2 仪器 5

2.2 实验方法 6

2.2.1 流动相的配置 6

2.2.2 粗品的溶解 6

2.2.3纯化方法 6

2.2.4分析方法 6

2.2.5色谱条件 7

第三章 结果与讨论 8

3.1粗品的溶解优化 8

3.2纯化后样品溶解优化 8

3.3粗品的HPLC图 9

3.4纯化后的HPLC图 10

3.5处理批次及得率 12

第四章 结论 13

4.1结果与讨论 13

4.2处理批次及得率 13

参考文献 14

致谢 16

第一章 文献综述

1.1利那洛肽相关简介

肽是由氨基酸组成的、蛋白质结构与功能片段。通过氨基酸的排列顺序不同，从而使蛋白质具有数以千万计的生理功能。由2个氨基酸脱水缩合而成的肽叫二肽，由此类推，依据其氨基酸组成数目可人为将2~5个氨基酸组成的称为短肽，6~16个氨基酸组成的称为多肽^[1]，17 个以上氨基酸组成的称为蛋白质。多肽在自然界中广泛存在，并且生物活性多肽具有免疫调节、激素调节、酶调节、抗病毒、抗氧化、降血压和降血脂等功能^[2-5]。

肠易激综合征（IBS）是一种逐年增加^[6]易复发的功能性慢性胃肠道疾病，也被称为过敏性结肠或结肠功能紊乱。1818年关于IBS症状就有相关报道^[7]，直到Dolkart等在20世纪40年代才提出了IBS的概念并且沿用至今^[8]，主要具有排便习惯紊乱、腹泻、腹痛、腹胀并伴有哮喘、偏头痛等症状，容易反复发作，严重影响了患者的生活质量，且间接增大了社会负担。由于缺乏特征性症状，所以IBS不易诊断，绝大部分患者需要3-5次以上的就诊才能明确诊断。

利那洛肽是由美国Ironwood公司研发用于治疗成人慢性特发性便秘（CIC）和IBS-C的一种GC-C受体激动剂，由14个氨基酸残基组成并包含3对二硫键的多肽药物。它可以通过增加肠道分泌、加速肠道运输来改善便秘症状和缓解腹痛，是目前发现的第一个具有这种双重作用机制的多肽药物。利那洛肽的出现对IBS-C患者无疑是一种福音，它可以很好的控制IBS这种慢性疾病。

1.2色谱技术分离多肽及研究进展

1.2.1高效液相色谱(HPLC)

高效液相色谱运用了气相色谱的相关理论，其流动相的输送动力是高压。色谱柱是由小粒径的填料填充而成，为了对流出物进行连续检测，在色谱柱后连有高灵敏度的检测器。依据固定相的性质不同，可将高效液相色谱分为离子交换液相色谱、反相高效液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型^[9]。

1.2.2离子交换色谱(IEXC)

离子交换色谱的主要原理是依据物质的带电性质、带电数量的不同而进行分析的。该技术具有分辨率高、耐酸碱性好、工作量大、便于操作等优点。Wu^[10]等在探讨分离牛碳酸酐酶异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件时，采用了离子交换柱层析法，从而获得了有价值的相关数据。刘璇^[11]等通过强阳离子交换色谱，调节pH 和离子强度，从苦瓜籽中分离一种活性多肽。尽管如此，在使用离子交换色谱时，不但在分离过程中易受到pH、分子量大小、离子强度以及盐浓度的影响，而且存在试验材料昂贵、再生性比较差、分离速度慢、分离纯化范围小、浓度高无法检测等缺点。

1.2.3反相高效液相色谱(RP-HPLC)

反相高效液相色谱是以液体为流动相的色谱技术，具有高灵敏度、高压、高速，柱子可以反复使用，分离效果较好，比较稳定、回收方便等特点。此外，反相高效液相色谱还具有溶解能力大，色谱柱效高，分离能力强，保留机理清晰的优点。多肽易受介质的pH值、外界温度、有机溶剂性质影响，上述优点能够良好地避免这些影响。杨化新^[12]等通过反相高效液相色谱法，利用C₁₈柱检测了重组人生长激素的肽片断，最终成功得到了人生长激素特征性胰肽图谱。Hartwick 等^[13]曾通过反相液相色谱监测腺苷的浓度，从而确定了红血球中腺苷脱氨酶的活性,利用类似的方法，测定了3’-AMP 合成酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、黄嘌呤氧化酶等的活性, 表现出反相液相色谱在这一领域的巨大潜力。

1.2.4疏水作用色谱(HIC)

HIC是利用多肽中含有疏水基团,可与固定相之间产生疏水作用，从而达到分离分析的目的。它与RP-HPLC相比，具有使较少多肽变性、分离的活性更为稳定的特点。Geng等^[14]利用HIC柱的低变性特点,将经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ,再通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。

1.2.5 分子排阻色谱 (SEC)

SEC是利用多肽分子大小和形状差异来实现分离纯化多肽物质的目的,特别是在分离一些较大的聚集态分子时比较方便。当出现一些分子量较大的肽或蛋白时，可利用此法进行分离分析。例如：我们可以利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法,此PEG具有半衰期长、作用强的优点^[15]。

1.3层析技术分离多肽及其研究进展

1.3.1亲和层析(AC)

亲和层析的作用原理是利用连接在固定相基质上的配基与可与和其特异性产生作用的配体之间的特异亲合性，从而达到分离物质目的的层析方法。它具有专一性强、亲和力好、效率高、容量大、对目标多肽具有保护作用和分离时不易发生非特异性吸附等优点，因而适用于分离微量的样品。邓文涛等^[16]利用亲和层析的方法分离得到了重组鲤鱼生长激素。

1.3.2毛细管电泳(CE)

毛细管电泳是在传统的电泳技术的基础上由本世纪60年代末Hjerten发明的,利用小的毛细管代替了传统的大电泳槽,结果使电泳效率提高了几十倍。

1.3.3毛细管区带电泳( CZE)

毛细管区带电泳分离多肽类物质的原理主要是依据不同组分中的化合物所带电荷的不同,并且分离效果只由带电性决定。Issaqc^[17]等利用CZE方法研究分离出5个含9个氨基酸残基的小肽,并且确定了小肽分析的基本条件（在低pH条件下,缓冲液中含有一定浓度的金属离子如Zn² 等,此时分离速度快而且准确）。

1.3.4胶束电动毛细管电泳( MEEC)

胶束电动毛细管电泳是一种采用色谱和电流相结合，在电泳液中加入表面活性剂，如SDS,使一些中性分子带一定电荷而分离的方法。有文献报道,在电解液中加入环糊精等物质,可使含疏水结构的多肽选择性与环糊精的环孔作用,从而利用疏水作用，达到多肽分离的目的^[18]。

1.3.5毛细管凝胶电泳( CGE)

毛细管凝胶电泳是基于分子筛的原理，试验中采用十二烷基磺酸钠( SDS) 处理蛋白或多肽，在电泳过程中主要依靠分子量和分子形状不同实现分离。有一种非交联、线性、疏水多聚凝胶柱被应用于多肽类物质的分离上，它具有易于灌注和使用寿命长的优点，但是这种技术产生热量高，凝胶的精密度要求也比较高^[19]。

1.4本论文的实验目的

本论文阐述的是在固相合成线性利那洛肽粗肽的基础上，通过查阅资料和实验等方式，找出影响分离效果的因素，归纳总结得出最佳的分离条件，并且利用高效液相色谱、层析等实验方法，将粗肽纯化，除去杂质，从而得到一个比较纯的肽。

第二章 实验方法

2.1 试剂与仪器

2.1.1 试剂

本实验中使用的主要药品试剂见表2-1。

表2-1 试剂名称、级别及生产厂家

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