论文总字数：21077字

摘 要

纤维素酶和半纤维素酶是酶解木质纤维素的关键酶，在饲料、食品、造纸和生物能源领域具有广泛用途。半/纤维素酶的制备一直是人们的研究热点。

通过对产纤维素酶和半纤维素酶的复合菌的单因素实验初步优化，得到最适培养条件为：温度为30℃，初始pH为9.0，碳源为1.0 %木聚糖和0.75 %羧甲基纤维素钠，氮源为1.25 %牛肉膏，接种量为0.6 %，装液量为20%，摇床转速为180 r/min，培养时间为60 h。

选用Plackett-Burman实验筛选出木聚糖，硫酸铵和磷酸二氢钾3个显著因素。通过最陡爬坡试验得出木聚糖（2 %），硫酸铵（0.2 %）和磷酸二氢钾（0.6 %）的最优浓度配比。经过响应面优化，得出产酶的最佳培养基配方：木聚糖2 %，硫酸铵为0.2%，KH₂PO₄浓度为0.6 %。在此最佳条件下，纤维素酶的酶活达到182.7713 U/mL。半纤维素酶活为690.0169 U/mL。

关键词： 纤维素酶 响应面法 纯化 半纤维素酶

Abstract

Cellulase and semi - cellulase enzymes are key enzymes for enzymatic hydrolysis of lignin.it was widely applied in feed, food, paper manufactureand bioenergy. The scanning and production of high activity xylanase have been a hot area of research for many years.

The fermentation process of The experimental strains was initially optimized by single-factor experiment to obtain the optimum operation conditions: temperature as 30 ℃, initial pH value as 9.0, xylan as 0.75% (m/V) and sodium carboxymethyl cellulose as 0.75%, Beef paste as 1.25% (m/V), load rate of culture medium as 0.6% (V/V), shaking speed as 180 r/min, and time as 60 h.

Three significant factors xylan , ammonium sulfate and KH₂PO₄ was finally determined via Plackett-Burman experimental. In addition, response surface methodology was applied to optimize the liquid state fermentation conditions, with the optimal conditions being listed as follows:xylan as 2% (m/V), ammonium sulfate as 0.2% (m/V), KH₂PO₄ as 0.6% (m/V) .Under optimal conditions,the cellulase production reached182.7713 U/mL,and the xylanase production reached 3693.91 U/mL.

Keywords: Cellulase; Response Surface Methodology; Purification; Hemicellulase

目 录

摘 要 1

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2木质纤维素及化学组成 1

1.2.1纤维素酶 2

1.2.2 半纤维素酶 3

1.2.3木质素 4

1.3微生物复合菌系协同降解木质纤维素的研究进展 4

1.4论文研究目的和主要研究内容 5

1.4.1研究目的 5

1.4.2 研究内容 6

第二章 纤维素酶与半纤维素酶高产菌株培养条件优化 7

2.1前言 7

2.2实验材料与仪器 7

2.2.1菌株来源 7

2.2.2培养基配方 7

2.2.3溶液配制 7

2.2.4实验试剂 8

2.2.5实验仪器 8

2.3 实验方法 9

2.3.1单因素条件优化实验 9

2.3.2 Plackett-Burman实验优化培养基组成 11

2.3.3最陡爬坡实验 11

2.3.4响应面优化 11

2.4.1单因素条件优化实验 11

2.4.2 Plackett-Burman实验优化培养基组成 18

2.4.3最陡爬坡实验 20

2.4.4响应面优化实验 21

第三章 结论与展望 26

3.1结论 26

3.2展望 26

参考文献 27

第一章 文献综述

1.1前言

近些年来，由于化石资源不可再生及其应用带来的环境问题，让人们对可再生资源和清洁能源的探究和开发日益关切^[1]。生物质因其庞大的储备量和可再生的优势，使得其成为一个极为重要的可再生资源和能源来源^[2]。开发利用生物质资源，具有巨大的潜力和价值^[3,4]。

中国是农业大国，存有大量生物质资源，如甘蔗渣、玉米芯、秸秆等农林业废弃物，长期以来未被充分利用。随着社会经济的快速发展，我国对资源需求巨大，因而带来了巨大的资源、能源危机。与此同时，环境问题也已迫在眉睫。因此，加快生物质资源的开发和全面充分利用，已成为我国当前面临的一个现实问题。

木质纤维素由纤维素、半纤维、木质素组成，三者通过特定的方式相互交联在一起形成一个稳定的难以降解的复杂结构。尽管许多微生物能分解单独存在的纤维素，但由于在细胞壁中纤维素受到木质素的保护，而木质素有完整坚硬的外壳，生物不易被微生物降解，因此，纤维素的分解受到限制。

在木质纤维素中，其中纤维素是D-葡萄糖线性聚合物，半纤维素是一大类类聚糖高分子物质，木质素是一类结构复杂的高聚物。由于生物质的结构和成分的复杂性，为了充分利用生物资源，往往通过各种物理和化学手段将其降解为单体，进而加以利用。其中，特别是通过不同酶的作用，可以温和地将其降解为不同的单体成分，进而用于不同领域。在这些酶中，最重要的是纤维素酶和半纤维素酶，前者用于降解纤维素，后者用于降解半纤维素。

1.2木质纤维素及化学组成

目前世界上最多的也是最难以利用的资源就是木质纤维素，但它的化学组成是简单的，是由D一葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键相联而成的线性聚合物，单个的木质纤维素链通过氛键和范得华力以平行取向彼此粘结，形成微纤丝，因为每个葡萄糖分子向邻近的分子倾斜180度角，所以木质纤维素的结构亚单位是纤维二糖；相邻和相近葡萄糖残基的分子间和分子内构成了氢键网络，分子间的氢键主要是协助保持木质纤维素链的刚性结构；微纤丝相互聚集形成纤丝，纤丝再进一步螺旋缠绕形成更高级的结构，同时木质纤维素主要成分是半纤维素、纤维素和木质素，半纤维素和木质素以共价键形式结合形成坚固的天然屏障，正因为这复杂的结构而难以被酶解。

1.2.1纤维素酶

自然界中有很多微生物能够分解纤维素，产纤维素酶的微生物大多属于真菌，其中研究较多的类群是丝状真菌，尤其以曲霉、木霉、青霉的能力最显著。木霉类群中的绿色木霉（Trichoderma viride）、拟康氏木霉（Trichoderma psoudokoningii）、康氏木霉（Trichoderma koniggii）、里氏木霉（Trichoderma ressiei）、黑曲霉（Aspergillus niger）等是高活性的代表菌种。

纤维素酶是由多种酶组成的复合酶，不同来源的纤维素酶各组分的比例、底物专一性都不同，组分间的协同作用促使纤维二糖和葡萄糖的生成，形成多种终产物，涉及数种反馈控制机理，因此测初速度难以反映底物特性；且纤维素酶作用的底物比较复杂，有结晶纤维素、再生纤维素等不溶于水的高聚糖，在反应体系中底物相对不足，所以酶反应初速度不能够代表酶活力大小；对固体的纤维素而言，酶与底物接触、产物扩散受到限制，影响酶活力的表现。

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