论文总字数：14541字

摘 要

石墨烯因其导电性能、机械性能和热学性能在电子、电池电容、传感器领域得到广泛应用。聚苯胺因其具有成本低、环境稳定性好、独特的氧化还原特性，在传感器的制备中倍受青睐。金是化学性质最稳定的金属元素之一，正是因为纳米金由于具有卓越的直接电子传递能力，已经被广泛用于纳米复合膜的制备。石墨烯/自掺杂聚苯胺-金纳米复合材料具有导电性强，生物相容性好，催化活性高等优点，在构建传感器方面得到了广泛的应用。本文制备了石墨烯-自掺杂聚苯胺-Au纳米复合材料，并将该材料修饰于预处理好的GCE电极表面，构建了一种无酶传感器，实现对过氧化氢的灵敏检测。在最佳实验条件下，该无酶传感器的线性范围为0.05-80.5 mmol/L，检测限为0.01 mmol/L.

关键词：石墨烯；自掺杂聚苯胺；纳米金；电化学生物传感；无酶；过氧化氢

ABSTRACT

Graphene is widely applied in the fields of electronics, battery capacity and sensors due to its electric conductivity, mechanical properties and thermal properties. Because of its low cost, good environmental stability and unique redox properties, polyanline has large popularity in the preparation of sensors. Gold nanoparticles has been widely used in the preparation of nanocomposities which can be ascribed to its excellent direct electron transfer ability and biocompatibility. Graphene/self-doping polyanline-Gold nanoparticles composites with strong conductivity, good biocompatibility, high catalytic activity has obvious advantages in terms of construction of a sensor. In this work, we modified the GCE electrode with the as-prepared nano composities, and designed an non-enzyme sensor for H₂O₂ detection. Under the optimum experimental conditions, the linear response to H₂O₂ is between the range of 0.05 and 80.5 mmol/L, the detection limit is 0.01 mmol/L.

Keywords: Graphene; Self-doped polyaniline; Gold nanoparticles; Non-enzyme electrochemical biosensor; Hydrogen peroxide

目 录

摘 要 1

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 4

1.1电化学生物传感器 4

1.2电化学生物传感器的应用 6

1.3本课题主要研究的内容和意义 8

第二章 石墨烯/自掺杂聚苯胺-金纳米复合材料及无酶电化学传感的制备 10

2.1前言 10

2.2 实验部分 10

2.2.1实验仪器 10

2.2.2实验试剂 11

2.2.3石墨烯/自掺杂聚苯胺-金纳米复合材料修饰电极的制备 11

第三章 结果与讨论 13

3.1 电极修饰过程的电化学表征 13

3.2 GO/SPANF-AuNPs修饰电极对过氧化氢的催化 13

3.3实验条件的优化 14

3.3.1pH的选择 14

3.3.2工作电位的优化 15

3.4石墨烯/自掺杂聚苯胺-金纳米复合材料修饰电极对H₂O₂的电催化还原性能表征 16

第四章 结论与展望 18

致谢 21

第一章 文献综述

1.1电化学生物传感器

1.1.1 电化学生物传感器的概念

电化学生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，以固定化的生物敏感材料作识别元件与相应的理化换能及信号放大电路构成的分析检测工具或系统。电化学生物传感器是具有接收与转换的功能，对其对应的特定生物物质敏感并将其浓度转换为对应处理芯片接收的电信号进行检测的仪器。

图1.1 电化学生物传感器的基本构成示意图

1.1.2 电化学生物传感器的分类

根据作为敏感元件所用生物材料的不同，电化学生物传感器可分为：电化学DNA传感器、电化学免疫传感器、酶电极传感器、微生物电极传感器等^[1-2] 。

（1）电化学DNA传感器

电化学DNA传感器的研究开辟了电化学与分子生物学的新领域，为生命科学的研究提供了一种全新的方法对临床医学和遗传工程的研究具有深远的意义和应用价值。今后电化学DNA传感器的研究将主要集中在以下几方面：①扩大电化学DNA生物传感器的研究领域，寻求其它技术与电化学DNA传感器的结合；②电极结构的优化，ssDNA在电极表面的固定化研究，发展稳定的自组装单分子层修饰电极；③药物特别是抗癌，药物在DNA修饰电极上的电化学机理研究，为药物的筛选提供依据；④电化学DNA传感器在临床基因诊断上的应用

研究；⑤高灵敏度高选择性杂交指示剂的筛选研究；⑥拓展电化学DNA传感的应用领域，使之渗透到食品卫生、医药领域、环境检测等生活实践中去；⑦电化学DNA传感器的人工智能化、微型化研究。近年来，石墨烯/自掺杂聚苯胺-金纳米在DNA传感器中的应用很广泛。Hao yuanqiang^[3]等人应用了一种新颖的电化学活性物质聚苯胺纳米线，构建了一种灵敏度高选择性好的DNA传感器，用于乙型肝炎病毒基因的检测。检测范围为2.0-800.0 fM，检测限为1.0 fM。Chang Liu^[4]等人设计了一种基于石墨烯-纳米金-聚苯胺纳米复合物的DNA传感器。用于结核杆菌的检测，利用该放大方法以及石墨烯，纳米金和聚苯胺之间的协同效应，该传感器检测范围非常广，为1.0×10^-15-1.0×10^-9 M。

（2）电化学免疫传感器

电化学免疫传感器是电流型传感器的一大分支，它是基于以抗体作为生物化学检测器，对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析的生物传感器。K. Pandiselvi^[5]等人运用简单的沉淀和化学聚合的方法合成了CS-ZnO/PANI 纳米复合物，将其修饰于玻碳电极的表面，用于免疫传感器的构建，利用该传感器检测多巴胺，检测范围为20×10^-5-180×10^-5 M，该传感器为简单有效的生物分子的检测提供了前景和希望。Akash Deep^[6]等人合成了一种苯乙烯磺酸掺杂的聚苯胺，并用3-氨丙基乙氧基硅烷将其功能化，修饰于丝网印刷电极表面，构建了草脱净传感器，该传感器灵敏度高，选择性强，稳定性好，性能优异。

1. 酶电极传感器

酶电极传感器是指用固定化的生物体成分酶作为传感元件的传感器。由于使用生物材料作为传感器的敏感元件，所以电化学生物传感器具有高度选择性，是快速、直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。酶传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型。基于电子媒介的葡萄糖传感器，具有响应速度快、灵敏度高、稳定性好、寿命长、抗干扰性能好等优点，尤为受到重视。如WenWei Tang^[7]等人分别用氧化法和溶胶的方法合成了Polyaniline/active carbon(聚苯胺/活性炭)和纳米级的TiO₂，并将其修饰于玻碳电极表面用于葡萄糖氧化酶的固定，制备了一种高灵敏度，高选择性的葡萄糖传感器，该传感器检测范围为0.02-6.0 mM，检测限为18 μM。Xiaojun Chen^[8]等人运用层层电沉积的方法制备了一种三维有序多孔自组装聚苯胺/普鲁士蓝（3DOM SPAN/PB）的双组份复合膜，用于电极的

修饰，构建的葡萄糖传感器响应时间短，选择性好，稳定性强，可用于实际样中血糖的检测。

1. 微生物电极传感器

微生物传感器以微生物活体作为识别元件，特别适用于需复酶和辅酶再生系统参与的生物反映测定，在生化需氧量和生物毒性等综合指标的检测上表现出独特优势。微生物传感器分析周期短，操作简便，自动化程度高，具有较高的精密度和准确度，节省了人力、物力，提高了工作效率，能广泛应用于地表水，生活污水及部分工业废水的测定。微生物传感器现已应用于生物工业，环境监测，临床医学等领域。如Hikuma^[9]等于1979年用固定化毛孢子菌制成的醇电极实现了对发酵罐中醇的测定。之后又于1980年利用固定化大肠杆菌制成的谷氨酸电极对发酵罐中谷氨酸的含量进行测定，得到令人满意的结果。Karube^[10]在1979年首先使用z”Dsce菌株制成了葡萄糖传感器，Mascini使用S.cerevisiae菌株制成了另一支葡萄糖传感器。二者均可检测发酵液中葡萄糖的含量，且后者实现了离线检测。1989年张先恩^[11]等将酿酒酵母菌固定在氧电极表面，用于蔗糖等低分子糖的测定，用动态法和稳态法测定糖的浓度有不同的线性响应，动态法响应范围高至100mg/L，稳定态仅达75mg/L。这种差异可归处于细胞与环境的综合效应，与测试搅拌速度，外部溶液的供氧能力，底物在传感器界面和细胞内的传质速率等因素有关。该微生物的电极用于以蔗糖为唯一碳源的类胡萝卜素微生物发酵过程的检测，样品需要量50L，测定结果显示底液中蔗糖消耗与生物量增长有明显的异向同步性。值得注意的是，微生物电极测定葡萄糖的浓度时，检出下限为10mol/L，而用酶电极为10mol/L。

1.2电化学生物传感器的应用

1.2.1 石墨烯在生物传感器中的应用

石墨烯是由碳原子六边形晶体格结构(蜂窝状)紧密排列而构成的二维单层石墨，是一种新型的二维纳米材料，如图1.2所示，结构非常稳定。作为碳系家族的一员，石墨烯，有着良好的应用前景，近年来已成为研究热点之一。石墨烯材料还兼有石墨和碳纳米管等材料的一些优良性质，例如高热导性^[12]和高机械强

度^[13]，以石墨烯制备的纳米复合材料也表现出许多优异的性能^[14]。石墨烯作为一种具有二维结构的新型碳基材料，因其具有更大的比表面积及高电子传导能力原料易得且价格便宜等优点，已成为继碳纳米管后新一代的理想电极修饰材料。在石墨烯功能化的研究中，经过酸处理的氧化石墨烯是最常用的功能化石墨烯，其片层之间存在的含氧基团，赋予其与溶剂之间较大的范德华力，使其易于溶剂化，此外，经过酸处理后，氧化石墨稀片层边缘的羰基使得氧化石墨稀具有更强的亲水性，这些都大大增强了其在水溶液中的溶解度和分散性，因而，经过酸处理的氧化石墨烯在构建生物传感器的应用中比较广泛。冯亚娟^[15]课题组通过经典的Hummer法将天然石墨粉氧化制得氧化石墨，利用超声分散法在蒸馏水中将氧化石墨剥片合成氧化石墨烯(GO)，将所合成的氧化石墨烯与三角形貌的金纳米颗粒(prismAuNPs)、辣根过氧化酶(HRP)和壳聚糖(CHIT)混合修饰到玻碳电极上制得过氧化氢传感器，实验结果表明，该传感器灵敏度高，响应迅速，具有良好的稳定性和重现性。唐点平^[16]课题组也通过Hummers法制备氧化石墨烯，将其用于聚邻苯二胺和金纳米颗粒的固定，得到的纳米复合物(graphene-carried poly(o-phenylenediamine)/gold hybrid nanosheets，GNPGs)作为标记物，放大信号，该传感器对CEA的检测限为5.0 pg/mL。

图1.2石墨烯的结构图

1.2.2 聚苯胺在生物传感器中的应用

聚苯胺是有机半导体中颇具有代表性的材料，聚苯胺分子内有大的线性共轭π电子体系，因而可以给载流子自由电子提供离域迁移的条件^[17]。导电聚苯胺容

易制备，环境稳定性好，并且可以通过简单的酸掺杂和脱掺杂来控制其物理化学性质，因而成为最具应用前景的导电高分子之一，并且可用于电化学传感器的构建。导电性能优良且环境稳定性好等优点已成为导电高分子领域中最有应用前景的品种之一^[18]。然而，单组份的聚苯胺存在着一下缺陷：机械性能差、耐酸性弱、电化学稳定性相对较弱，而且只有当所在溶液PH值小于4时，单组份的聚苯胺才会表现出电化学活性，这些大大增大了聚苯胺纤维在生物电化学领域应用的局限性。为了弥补这些缺陷，自组装聚苯胺纤维(SPAN)被开发出来，在免疫传感器制备应用中，这些自掺杂聚苯胺能在中性乃至碱性溶液中保持电还原活性。近年来，有关各类自掺杂聚苯胺(SPAN)应用于传感器构建的文献相继被报道出来。Zhang ^[19]和他的团队设计了一种新颖的Fe₂O₃/SPAN纳米纤维/碳离子液体电极，用于DNA杂交的检测；Chen^[20] 和他的团队开发了一种独特的纳米金/碳纳米管/自组装聚苯胺(AuNPs/CNTs/SPAN)空心球体，用于无酶过氧化氢传感器的构建。

1.2.3 纳米金在生物传感器中的应用

纳米金是化学性质最稳定的金属元素之一，正是因为纳米金由于具有卓越的直接电子传递能力，已经被广泛用于纳米复合膜的制备，从而广泛应用于电化学传感器的研究。如Mirkin^[21]把纳米金作为DNA的载体，这种方法是DNA一端结合的巯基（-SH），与纳米金之间通过自组装形成的Au-S共价键进行结合，计算出纳米金颗粒上DNA的密度为34pmol/cm²，在半径为15.7nm的金颗粒上，可以标记159个ss-DNA(12base)。李金花^[22]在纳米金上同时负载二茂铁和目标DNA，然后通过目标DNA与探针DNA杂交，将大量二茂铁引入电极附近，通过伏安法测定二茂铁的氧化还原电流，间接测定溶液中互补的目标DNA，检测限可达10^-12mol/L。Wang^[23]通过在金纳米颗粒表面固定IgG抗体，构建三明治结构用以检测IgG，使得检测IgG的信号大大扩增。

1.3本课题主要研究的内容和意义

过氧化氢(H₂O₂)在食品工业，临床应用，环境分析等领域有着广泛的应用，因此发展可靠、灵敏、快键、低成本的H₂O₂检测方法具有重要意义。目前，H₂O₂

检测方法包括滴定法，光谱法，荧光法，化学发光法，色谱法及电化学法^[24]。其中，电化学法应用最为广泛，因为它们具有操作简便、高效、高灵敏度和高选择性等优点。许多文献报道采用辣根过氧化物酶修饰的电化学生物传感器测定H₂O₂，但通常酶电极的制备过程复杂且酶作为具有活性的生物大分子，对外界条件的变化比较敏感，容易失活变性，影响传感器的寿命和测定结果的准确性，因此在实际应用中受到了一定的限制^[25]。所以，基于无酶传感器的H₂O₂检测逐渐引起人们的兴趣。

本文合成了自掺杂聚苯胺，Hummer’s方法制备氧化石墨烯，制备了石墨烯-自掺杂聚苯胺-Au纳米复合材料，并将该材料修饰于预处理好的GCE电极表面，构建了一种无酶传感器，实现对过氧化氢的灵敏检测。并对实验过程中的外加电位及底液pH值进行条件优化，同时应用，循环伏安法（CV），计时电流法等分析手段进行表征和分析。

第二章 石墨烯/自掺杂聚苯胺-金纳米复合材料及无酶电化学传感的制备

2.1前言

石墨烯(graphene, Gr)因其导电性能、机械性能和热学性能在电子、电池电容、传感器领域得到广泛应用。聚苯胺因其具有成本低、环境稳定性好、独特的氧化还原特性，在传感器的制备中倍受青睐。金是化学性质最稳定的金属元素之一，正是因为纳米金由于具有卓越的直接电子传递能力，已经被广泛用于纳米复合膜的制备。石墨烯/自掺杂聚苯胺-金纳米复合材料具有导电性强，生物相容性好，催化活性高等优点，在构建传感器方面得到了广泛的应用。本实验制备了石墨烯-自掺杂聚苯胺-Au纳米复合材料(GO/SPANF-AuNPs)，并将该材料修饰于预处理好的GCE电极表面，构建了一种无酶传感器，实现对过氧化氢的灵敏检测，取得令人满意的结果

2.2 实验部分

2.2.1实验仪器

表2.2.1主要的实验仪器

2.2.2实验试剂

表2.2.2实验所用主要的试剂

2.2.3石墨烯/自掺杂聚苯胺-金纳米复合材料修饰电极的制备

（1）氧化石墨烯的制备

（一）预氧化步骤

1. 250 ml三口烧瓶，13 ml浓H₂SO₄ 2.5 g K₂S₂O₈ 2.5 g P₂O₅，逐渐升温至90 ℃至样品全部溶解，然后降温至80 ℃（机械搅拌）。

2. 加入3 g进口石墨，在80 ℃条件下反应4-5 h，然后冷却至室温。

3. 用500 ml水稀释（搅拌30 min）过夜，抽滤，再用水洗至中性，在60 ℃下真空干燥。

（二）再氧化

1、250 mL三口烧瓶加入40 mL(或36 mL、38 mL)浓H₂SO₄，冰浴至0 ℃左右，逐渐加入预氧化样品1 g左右(机械搅拌)，温度保持不变。

2. 缓慢加入5 g KMnO₄(温度不超过10 ℃)，撤掉冰浴，室温下搅拌10 min。

3、然后升温至35 ℃反应8 h，颜色逐渐变为黑褐色。

4、缓慢加入80 mL H₂O，温度不能超过50 ℃(换掉原先的水，用冰浴，过一会儿再滴加，期初一滴滴的加，注意搅拌)，搅拌2 h，溶液变成黄褐色。

5、再加入230 mL H₂O(搅拌均匀)，逐滴加入H₂O₂ (30%) 2~3 mL至不再产生气泡为止，颜色为亮黄色，搅拌30 min，过夜(H₂O₂用来去除KMnO₄)。

6、离心(上层倒掉)9000或9500 r/min，用10 %的HCl洗去SO₄^2-，一般4次可以洗掉，用1 % BaCl₂检测SO₄^2-。

7、再次用水洗至中性(越接近中性越难离心)，超声3 h，然后3000 rpm离心30 min。真空干燥，得到GO。

（2）自掺杂聚苯胺（SPANF）的制备

取0.11 g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）溶解于40ml溶有0.23g AN（苯胺）和0.43 g SAN（3-氨基苯磺酸）的HCl（0.15mol）中。然后，加入20 ml 0.06 mol的APS溶液，此时发生聚合反应。该聚合反应需要在4 ℃下静态反应24 h。最后，将反应的物质进行离心、洗涤，并在60 ℃下干燥，即可得到深绿色的固体沉淀，这就是自掺杂聚苯胺。

（3）SPANF-AuNPs的制备

金胶按照文献^[26]介绍的方法合成。SPANF-AuNPs 合成的过程如下：首先，将之前制得的SPANF 分散在PDDA 溶液中，搅拌20分钟，得到带有正电荷的SPANF。用二次水充分洗涤之后，将其溶解在250 mL金胶中，快速搅拌8 h使其充分反应。离心，洗涤，真空干燥24 h，得到深红色固体，即SPANF-AuNPs 纳米复合物。

（4）生物传感器的制备

分别用丙酮、乙醇、二次水超声清洗玻碳电极（GCE）15 min，氮气吹干，备用。将预先制备的GO乙醇分散液(3mg/mL)，SPANF-AuNPs乙醇分散液(2mg/mL)先后滴涂在GCE表面，4 ℃下干燥，备用。以GO/SPANF-AuNPs复合膜修饰玻碳电极(GCE)为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，连接成三电极体系，进行电化学检测。

第三章 结果与讨论

3.1 电极修饰过程的电化学表征

用循环伏安法分别对裸电极和修饰后的电极进行表征，实验在0.5 mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4- 0.1 mol/L KCl 磷酸盐溶液中进行。电位区间为-0.2～0.6 V，扫描速率为100 mV/s。从循环伏安图可以看出，当电极修饰了石墨烯后，峰电流变大，这说明石墨烯的修饰增强了电极的导电性，当电极进一步修饰了SPANF-AuNPs后，电流显著增强，这是由于自掺杂聚苯胺和纳米金赋予了电极更强的导电性，有利于电子在溶液和电极表面的传递。

图3.1 裸玻碳电极(a)、GO/GCE（b）、GO/SPANF-AuNPs/GCE (c)的CV表征

3.2 GO/SPANF-AuNPs修饰电极对过氧化氢的催化

我们用CV的方法研究了该无酶传感器对过氧化氢的催化，从图中我们可以看出，在无H₂O₂存在时，分别于-0.17 V和0.09 V处有一对氧化还原峰，当加入0.1 mM H₂O₂后，还原峰电流明显增强，氧化峰电流减弱，这是由于该修饰电极对H₂O₂催化的结果。

图3.2于0.1 M PBS (pH=7.0)中(a) 无H₂O₂存在；(b) 0.1 mM H₂O₂ 存在下GO/SPANF-AuNPs/GCE CV的比较

3.3实验条件的优化

为了最大限度地提高H₂O₂生物传感器的检测灵敏度，对各种条件均做了优化，包括电解液的pH值，电极的工作电压等。

3.3.1 pH的选择

电解质溶液的pH值是影响生物传感器响应的一个重要参数。图3.3.1显示了传感器在pH值范围为5.0到7.5的响应电流。从图3.3.2中可以发现，传感器对H₂O₂的响应在pH为6.5时最大。因此所以选择pH=6.5的PBS为最佳的电解液。

图3.3.1 传感器在pH=5(a)、pH=6(b)、pH=6.5(c)、pH=7(d)、pH=7.5(e)下的响应电流与时间的关系

表3.3.1为不同pH下的催化电流值：

表3.3.1 不同pH下的催化电流值

3.2.2工作电位的优化

修饰电极所产生的还原电流与检测电位密切相关，为确定对H₂O₂进行安培检测的最佳工作电位，在PBS(pH=6.5)中研究了工作电位对修饰电极电流响应的影响，如图3.3.2所示。修饰电极对H₂O₂的电催化还原电流起始于-0.05 V，随着工作电位的负移，电流响应逐渐增大。这是由于电位的负移促进了H₂O₂还原。当电位在-0.2—-0.5V之间时，响应电流略微下降，这是因为在过低电位下基质对电极干扰严重。所以本实验最终选择-0.2 V作为安培检测实验的工作电位，既保证了背景电流和噪音足够小，也减少了溶液中其它电活性物质对于H₂O₂检测的干扰。

图3.3.2传感器在-0.05V、-0.10V(b)、-0.20V(c)、-0.30V(d)、-0.40V(e)和-0.50V(f)下的响应电流与时间的关系

表3.3.2为不同工作电位下的响应电流值：

表3.3.2不同工作电位下的响应电流值

3.4石墨烯/自掺杂聚苯胺-金纳米复合材料修饰电极对H2O2的电催化还原性能表征

选取pH值为6.5的PBS作为电解质，在工作电位为-0.20V，检测石墨烯/自掺杂聚苯胺/GCE对H₂O₂的催化性能。图3.4 A显示了在最佳条件下，向PBS电解液里连续加入H₂O₂后的安培响应。如图所示，达到最大稳定电流的95%时所需的时间为5 s。实验证明，在0.05-80.5 mmol/L范围内，不同浓度的H₂O₂催化峰电流信号呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=3.8439 0.5238x，相关系数R=0.999， (图3.4 B)。在信噪比为3时，检测限为0.01 mmol/L。

图3.4 (A) GO/SPANF-AuNPs/GCE催化0.1~61.5 mmol/L (a-t) 的H₂O₂响应电流；(B)不同浓度H₂O₂与响应电流值的关系

第四章 结论与展望

本文用层层自组装的方法制备出石墨烯/自掺杂聚苯胺-纳米金复合膜修饰的玻碳电极，制备了一种无酶过氧化氢传感器。用循环伏安法分别对裸电极和修饰后的电极进行表征。实验证明，该复合膜对H₂O₂有很好的电催化活性。在实验过程中，为了最大限度地提高H₂O₂传感器的检测灵敏度，对各种条件均做了优化，包括电解液的pH值，电极的工作电压等。实验表明，pH=6.5的PBS为最佳的电解液，-0.2 V作为安培检测实验的工作电位，既保证了背景电流和噪音足够小，也减少了溶液中其它电活性物质对于H₂O₂检测的干扰，用计时电流法H₂O₂进行电化学检测，取得了令人满意的结果。

请支付后下载全文，论文总字数：14541字