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摘 要

1,4-丁二胺（1,4-diaminobutane）也被称为腐胺（putrescine），是生物活体或尸体中蛋白质的氨基酸降解产生的。1,4-丁二胺与己二酸的反应可用于生产棉纶尼龙-46。另外，它也是制备尼龙-6及尼龙-66的原料；可作为生物化学试剂、化学中间体及生化前导物；亦可作为酸性气体吸收剂。

在丁二胺生物合成细胞工厂中，增加其前体物质谷氨酸和鸟氨酸的胞内浓度，理论上有利于提高丁二胺合成途径的代谢通量进而提高产量。氨基酸从胞内分泌到胞外依靠的是转运蛋白。研究谷氨酸和鸟氨酸转运蛋白对实现丁二胺的过量生产有一定的指导意义。本文试图从氨基酸分泌的角度出发，通过增加胞内谷氨酸和鸟氨酸浓度，进而提高丁二胺合成途径的代谢通量最终提高其产量。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为研究对象，通过基因敲除的方法对谷氨酸转运蛋白和鸟氨酸转运蛋白LysE和NCgl1221在其发酵生产丁二胺中的作用作初步研究，以期使得菌株的丁二胺产量有所提高。

利用自杀载体pK18mobsacB分别成功敲除了谷氨酸棒杆菌ATCC13032的lysE基因和NCgl1221基因，获得 lysE基因缺失菌△lysE/ C. glutamicum ATCC 13032和△NCgl1221/ C. glutamicum ATCC 13032。

关键词：丁二胺，转运蛋白，LysE，NCgl1221，谷氨酸棒杆菌

ABSTRACT

1,4-diaminobutane, or putrescine, which is an organic chemical compound, is produced by the breakdown of amino acids in living and dead organisms. The reaction between putrescine and adipic acid can be used to produce nylon-46. In addition, it is the raw material of nylon-6 and nylon-66. Putrescine can also be used as biochemical reagents, chemical intermediates, biochemical precursor substances and acid gas absorbents.

In the cell factory of putrescine biosynthesis, increasing intracellular concentration of putrescine precursors L-glutamic acid and L-ornithine theoretically helps to increase the putrescine metabolic pathway flux thus increasing the synthesis of the putrescine. Through the transporting protein amino acid excretes from inside to outside of cells. Hence, the transporting protein of L-glutamic acid and L-ornithine might be worth investigating in putrescine overproducing. This paper studied the strain C. glutamicum ATCC 13032 by gene disruption to verify the function of amino acid transporter protein LysE and NCgl1221 in putrescine fermentation, hoping to achieve the purpose of increasing putrescine production.

In this paper we respectively knocked the lysE gene and NCgl1221 gene out of C. glutamicum ATCC 13032 successfully by use of suicide vector pK18mobsacB and obtained lysE deletion mutant △lysE/ C. glutamicum ATCC 13032 and NCgl1221 deletion mutant △NCgl1221/ C. glutamicum ATCC 13032.

Key words: putrescine, transporting protein, LysE, NCgl1221, Corynebacterium glutamicum

目录

摘要 I

ABSTRACT II

目录 III

第1章 绪论 1

1.1 1,4-丁二胺简介 1

1.2 氨基酸转运蛋白的研究进展 3

1.3 棒杆菌氨基酸转运蛋白的研究进展 3

1.4 本文的研究目的和研究内容 5

1.4.1 本文的研究目的 5

1.4.2 本文的研究内容 5

第2章 材料与方法 7

2.1 菌株和质粒 7

2.2 PCR引物及基因扩增 7

2.3 培养基与培养方法 8

2.3.1 培养基 8

2.3.2 培养方法 8

2.4 主要试剂 8

2.4.1 生化试剂 8

2.4.2 工具酶及其它 9

2.5 主要仪器 9

2.6 实验方法 10

2.6.1 发酵参数分析 10

2.6.2 分子克隆相关常规操作 11

2.6.3 谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备及电转方法 11

2.6.4 谷氨酸棒杆菌基因的敲除 12

第3章 结果与讨论 15

3.1 氨基酸转运蛋白 lysE基因缺失菌株的构建 15

3.1.1 氨基酸转运蛋白 lysE 基因内缺失片段的克隆 15

3.1.2 谷氨酸棒杆菌lysE基因缺失株△lysE/ C. glutamicum ATCC 13032的获得 15

3.2 膜蛋白跨膜区预测 16

第4章 结论与展望 17

参考文献 18

致谢 24

第1章 绪论

1.1 1,4-丁二胺简介

多胺是一种在大多数活细胞中存在的物质。属于多胺的亚精胺或精胺可在不同物种例如细菌、真菌和动物中发现。1,4-丁二胺（或腐胺）是亚精胺或精胺代谢中的前体，可在革兰氏阴性菌或真菌中发现，它在不同物种中以很宽的浓度范围存在，表明其在代谢通路中具有很重要的作用。

1,4-丁二胺是多胺尼龙-4,6合成中的基本材料，通过1,4-丁二胺与脂肪酸的反应可生成多胺尼龙-4,6。1,4-丁二胺在加工塑料的生产中作为原料被使用，它通常通过包括丙烯转换为丙烯腈和琥珀腈的化学合成来生产得到。此化学合成由三步工艺组成，包括消耗大量能量的催化氧化反应、使用有毒化学品例如氰化物的反应以及使用高压氢气的加氢反应。通过化学合成生产1,4-丁二胺是不环保的，并且还会消耗大量能量导致石油资源枯竭。因此，需要开发涉及生物量利用的更为环保和高能效的方法来进行1,4-丁二胺生产。

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