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摘 要

合成(S)-CHBE还原反应过程通常是由还原酶烟酰型辅酶NAD(P)H介导的，它伴随着辅因子NADPH的消耗。但是辅因子价格昂贵，稳定性差，因此，辅因子的保留和循环再生是降低生产成本的重要环节。基于以上信息，课题组拟运用电化学的方法实现辅因子的再生，手性合成(S)-CHBE。此外，为了解决在单一水相中，酶的稳定性差、产物浓度低且不易分离的问题，本课题采用了水/醋酸丁酯的非单一水相体系，建立电化学反应-分离耦合体系，在电化学反应器中不对称合成(S)-CHBE。

图1 COBE 图2 （S)-CHBE

关键词：酶催化；辅酶再生；电化学；4-氯乙酰乙酸乙酯；(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；

Abstarct

The reduction reaction of (S)-CHBE is usually hmediated by NAD (P) , it is accompanied by the consumption of NADPH .But cofactors is expensive and poor stability ，therefore the retention and recycling of cofactors is important for reducing costs.Based on the above information, in order to achieve the synthesis of chiral (S)-CHBE ,the research group intends to use electrochemical methods to achieve the regeneration of cofactor .Furthermore, in order to solve poor stability of the enzyme,low product concentration in a single aqueous phase, and the problem of separated with difficulty,this study uses the system of water / butyl acetate,and establishing an electrochemical reaction - separation coupling system to synthesis (S)-CHBE in the electrochemical reactor.

Fig1 COBE Fig2 （S)-CHBE

Key words：Enzymatic ; regeneration of Coenzyme ; electrochemistry;ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate ester；ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate ester；

目录

摘 要 I

Abstarct II

第一章 文献综述 1

1.1 电化学与酶催化手性合成 1

1.1.1电化学及其在相关学科和领域的应用 1

1.1.2 酶催化不对称合成 2

1.1.3 酶催化不对称合成的机制 2

1.2酶催化制备S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 3

1.2.1 （S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)及其研究意义 3

1.2.2 （S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的合成进展 4

1.2.3 酶催化合成(S)-CHBE的问题与应对策略 5

1.3 酶催化合成(S)-CHBE的辅酶再生系统的构建 5

1.4本课题的研究背景及研究思路 6

1.4.1 研究背景 6

1.4.2 研究思路 6

第二章 PsCR纯酶的提取 7

2.1 材料与方法 7

2.1.1 实验材料与仪器 7

2.1.2 提纯方法 8

2.2 分析方法 10

2.3 结果与讨论 10

2.3.1 SDS-PAGE电泳 10

2.3.2 蛋白定量 11

2.3.3 酶活测定 11

2.3.3 结果讨论 11

第三章电化学构建辅因子再生系统实现制备(S)-CHBE 12

3.1 材料和方法 12

3.1.1 实验材料 12

3.2分析方法 13

3.3结果与讨论 13

第四章 结果与讨论 19

4.1 结果 19

4.2 结果讨论 19

第五章 前景与展望 21

参考文献 23

致谢 25

第一章 文献综述

1.1 电化学与酶催化手性合成

1.1.1电化学及其在相关学科和领域的应用

电化学是研究电和化学反应相互关系的科学。电和化学反应相互作用可通过电池来完成，也可利用高压静电放电来实现，二者统称电化学。在物理化学的众多分支中，电化学是唯一以大工业为基础的学科。电催化是使电极、电解质界面上的电荷转移加速反应的一种催化作用^[1]。目前对能源利用、燃料电池和某些化学反应（如丙烯腈二聚、分子氧还原）的电催化作用研究得较深入，今后在开拓精细有机合成方面可能会得到较大的进展，特别是对那些与电子得失有关的氧化还原反应。

利用氧化还原酶来还原羰基可以得到光学纯度极高的手性醇类化合物。反应需要辅酶NAD(P)H[ 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸) ]的参与。NAD(P) H 大分子是生物代谢过程中的一种重要的辅酶。其氧化态NAD 在生物燃料分子降解过程中作为电子受体被还原, 其还原态NAD(P) H 在生物合成过程中作为一种手性还原剂, 为生物大分子提供电子和自由能。但是大部分由脱氢酶所催化的反应的热动力学值都不佳。因而引入一不可逆的电化学反应，对NADH进行电化学氧化似乎是驱动酶反应的一个好方法^[2]。此外，相比于其他实现辅因子的重生的方法，电化学法是通过电极的电子传递直接实现辅因子再生，不需要引入其它酶和底物，避免了副产物，不仅经济，而且环保。因而电化学法备受关注。

电化学法通过电极电子的传递直接实现辅因子再生，不需要引入其它酶和底物，避免了副产物。其反应原理为：NAD H 2e=NADH ^[3]。近二十年来．电化学法应用于辅因子的再生，不仅经济有效而且环保，非常符合当今社会发展绿色工业的要求。所以电化学被认为实现工业可持续发展极具希望的技术。

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