论文总字数：10809字

摘 要

通过PCR技术扩增获得目标的腈水解酶基因，再将目标基因插入pET-22B的Nde I位点和Sal I位点之间，构建来源于Acidovorax facilis 72W腈水解酶原核生物表达质粒pET 72W。并将该质粒转入至宿主BL21 (D E3)中，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定和酶活鉴定，该基因在大肠杆菌BL 21 (D E3)中成功表达。

关键字：腈水解酶 PET-22B 基因工程 SDS-PAGE 酶活性

From the construction and expression of the prokaryotic expression system of Acidovorax facilis 72W nitrile hydrolase

Abstract

through the PCR technology in the laboratory synthesis of target nitrilase, then through genetic modification of genetic engineering steps, between the target gene was inserted into pET-22b Nde I and Sal I, building Acidovorax facilis 72W nitrilase prokaryotic expression vector pET 72W. The recombinant clone by SDS-PAGE gel electrophoresis, in Escherichia coli BL 21 (D E3) expressed in a specific protein, and enzyme activity determination.

Keywords: nitrilase, pET-22B, genetic engineering, SDS-PAGE, enzyme activity

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 睛水解酶 1

1.2 本论文的研究内容与意义 2

第二章 重组质粒的构建 3

2.1 实验材料 3

2.2 基因的来源 5

2.3 感受态大肠杆菌的制备 6

2.4 构建的T载体的蓝白班筛选 6

2.5 T载体和载体质粒DNA提取 7

2.6 质粒的构建 7

2.7 连接产物转化大肠杆菌 8

2.8 质粒DNA提取与酶切鉴定 9

2.9 PET-22B 72W诱导表达，提取及鉴定 9

第三章 结果与讨论 12

3.1 基因的扩增与鉴定 12

3.2 载体的获得 12

3.3 载体的酶切反应 13

3.4 目标基因的胶回收 13

3.5 基因重组表达载体的酶切鉴定 14

3.6 诱导表达蛋白质、SDS-PAGE电泳 14

3.7 酶活测定 15

第四章 结论与展望 16

4.1 结论 16

4.2 展望 16

致谢 17

参考文献 18

第一章 文献综述

1.1 睛水解酶

腈化合物(R-CN)是一类非常重要的化合物,它的种类非常的繁多,现在自然中和人工合成的各类腈类化合物总数超过了 20000多种,然而在所有的腈类化合物中,大部分来自于人工合成^[1]。腈类化合物也可以通过植物自身的合成产生,往往可以作为激素的前体物质(苯乙腈),或者植物体内的存储化合物(腈脂)等等^{[1, 2]}。我们都知道,腈类化合物在工业上的重要应用是其往往能够作为底物,然后通过化学方法合成一些所需的医药中间体或者其他有用的物质。然而,目前工业上的腈类水解所采用的化学方法受到很大局限,因为其需要非常苛刻的条件,比如强酸、强碱或者高压等,而且产生的不期望的副产物具有一定的毒性,容易对环境造成危害。截然不同的是,腈类物质通过生物催化来产生对应的羧酸和酷胺类物质,此过程能够在很温和的条件下发生,而且产物具有较高的立体选择性^[3]。通过大家都广泛熟悉的例子,比如丙烯酰胺的生产,生物法转化腈类化合物的潜力已经得到了证明^[4]。腈类化合物的生物催化目前来说,主要是通过两种途径。一种是腈类化合物在腈水解酵的作用下通过一个直接的生物转化,释放氨从而形成对应的羧酸^[5]。在80年代初,另外一种生物催化腈类化合物的方式也被发现,首先腈类化合物被水解成为酰胺类物质,随后再在酰胺酶的作用下生成对应的羧酸^[6]。

腈水解醇,作为第一个腈类转化醇,大概最早是在40年前发现,能够水解有机腈产生羧酸和氨。其因为能够转化3-吲哚乙腈生成3-n引哚乙酸而闻名^[7]。不像腈水合酶,腈水解酶在自然界各种存在的生物中发现,包括细菌、真菌、古细菌、植物和哺乳动物,其中细菌是腈水解酶的主要来源^[8]。

腈类化合物是一类非常重要的物质,其衍生的酰胺类物质已经羧酸类物质在医药、化学合成等方面有着广泛的应用^{[1, 4]}。而目前工业上对于腈类化合物主要采用的是化学水解法。这种方式往往需要高压、高温、强碱和强酸等苛刻条件,副产物多,污染重,而且对设备和人员操作有很高的要求。而利用酶法催化生产酰胺和羧酸类物质,因其反应条件温和、副产物少,以及具有一定的区域、化学、对映体选择性而受到越来越多的关注^{[9, 10]}。本课题以苯甘氨腈为底物,通过腈水解醇来催化氰基水解生产苯甘氨酸,而其中苯甘氨酸是医药生产中很重要的一种中间体。同时通过对腈水解酶进行氨基和环氧载体固定化,为将来工业化应用打下基础^{[11, 12]}。

1.2 本论文的研究内容与意义

(1) 腈水解酶基因的获取及质粒的构建

(2) 腈水解酶在原核生物体内的表达

(3) 蛋白质的测定及酶活的测定

第二章 重组质粒的构建

2.1 实验材料

2.2.1 主要仪器

本论文中所用的实验设备及仪器如表 2-1 所示。

表2-1实验仪器

2.1.2 实验试剂

本论文中所用的实验试剂如表 2-2所示。

表2-2实验试剂

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