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吞噬细胞在细菌和真菌感染以及无菌炎症中的作用:以斑马鱼为例

对感染和无菌损伤(伤口，组织创伤或晶体沉积)的立即和自然反应是急性炎症反应。这种炎症反应是由主要由专业吞噬细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)组成的先天免疫系统激活介导的。斑马鱼幼鱼作为一种模式生物具有许多优点，包括其易于遗传操作和高度保守的先天免疫系统。利用这些属性和光学透明斑马鱼幼鱼的活体成像潜能，有助于我们理解中性粒细胞和巨噬细胞如何协调炎症反应的启动和消退阶段。以斑马鱼为动物模型成功建立了大量的细菌和真菌感染模型，研究中性粒细胞和巨噬细胞对无菌损伤的行为也提供了独特的见解。在这篇综述中，我们重点介绍了斑马鱼幼鱼对特定细菌和真菌病原体的反应，揭示了各种吞噬细胞反应背后的细胞和分子机制，包括那些保护宿主和那些有害的。我们还描述了如何在斑马鱼幼鱼中建立无菌炎症模型，提供了一个机会来剖析控制炎症部位吞噬细胞招募和命运的信号通路。最后，我们简要讨论了目前斑马鱼吞噬细胞生物学模型系统的局限性和改进的机会。

介绍

斑马鱼(danio rerio)是一种成熟的用于研究多种生物和病理过程的模式生物。这些研究范围从发育生物学、遗传学、癌症、神经生物学疾病，心血管疾病以及代谢和传染病。斑马鱼胚胎和幼鱼具有独特的特性，因为它们是体外受精的，因此在其快速的生命周期中很容易接触到发育中的胚胎。此外，成年斑马鱼可以在每周的基础上产生大量的后代，并且幼鱼是光学透明的，物理特性可以利用转基因报告系进行非侵入性的活体成像。关于活体成像免疫反应，标记不同类型吞噬细胞的转基因株系，从而能够观察在活动物上对伤害和感染的炎症反应。此外，在感染研究中同时使用荧光标记的病原体可以实时观察宿主-病原体在体内的相互作用。除了成像的潜力和遗传适应性，斑马鱼模型提供了高通量药物筛选的能力，以促进抗菌药物的发现和深入的毒性因素研究。

另一个主要优势在于人类和斑马鱼的基因组具有高度同源性，而且免疫系统高度保守。尽管斑马鱼免疫系统的发育起源在某种程度上不同于哺乳动物，但所有主要相关的免疫细胞类型都已在鱼类中被描述，包括先天免疫系统的吞噬细胞。先天免疫系统提供了抵御病原体入侵的第一道防线，由物理屏障、生化效应分子如补体因子、抗菌肽、细胞因子(趋化因子、干扰素和白细胞介素)和吞噬细胞组成。补体系统的一个主要效应功能是调理病原体和招募专业吞噬细胞，如巨噬细胞和中性粒细胞。

巨噬细胞和中性粒细胞是高度迁移的细胞，既能吞噬病原体，又能杀死病原体。吞噬作用在防御入侵的病原体、组织炎症和连续的愈合过程中起着中心作用，在愈合过程中巨噬细胞和中性粒细胞清除细胞碎片并恢复组织稳态。除了识别调理素外，吞噬还可以通过病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)与巨噬细胞和中性粒细胞上的模式识别受体(PRRs)相关联而被触发。一旦病原体被内化，它们驻留在细胞内的液泡中，即吞噬小体，并进一步成熟为吞噬溶小体，从而启动有效的杀伤机制。此外，膜结合或细胞内滞留的toll样受体(TLRs)，属于PRRs，有助于有效识别病原体和激活吞噬细胞。TLR的激活激活了下游信号通路，如激活B细胞NF-KB的核因子kappa轻链增强剂，从而导致专业吞噬细胞产生和释放促炎细胞因子。利用NF-kappa;B识别序列和免疫应答基因(包括促炎细胞因子)的启动子，分化中性粒细胞和巨噬细胞激活状态，已经产生了转基因斑马鱼报告系。这些线索已经在开始显示,仪器的功能异质性斑马鱼的吞噬细胞类似于哺乳动物的同行。

在炎症反应中，中性粒细胞和巨噬细胞的作用通常是互补的，然而，它们募集的动力学可能是可变的，取决于损伤的来源。中性粒细胞通常是组织损伤和病原体入侵后的第一个反应者，除非巡逻的组织驻留巨噬细胞首先遇到微生物。不管损伤的来源是什么，次级专业吞噬细胞群通常在那之后不久被招募。两种吞噬细胞对组织损伤和感染的反应主要是通过吞噬外来颗粒或组织碎片。然而，中性粒细胞通过脱粒，产生活性氧，有更强大杀菌活性，能形成中性粒细胞细胞外陷阱；巨噬细胞在吞噬溶酶体内破坏病原体和碎片以供抗原呈递，并释放细胞毒性因子并启动趋化因子和细胞因子的产生。斑马鱼和哺乳动物之间所描述的所有与固有免疫反应对抗病原体或损伤相关的途径和下游成分都是非常保守的。斑马鱼幼体免疫系统的一个有趣特性是，免疫系统的适应性臂大约需要3-4周的时间来发育。这就创造了一个独一无二的机会来研究在早期胚胎和幼鱼阶段不受适应性免疫干扰的先天反应。此外,药物和基因技术的存在是为了专门耗尽白细胞在斑马鱼子集,包括使用巨噬细胞的氯膦酸二钠脂质体消融和转基因线硝基还原酶介导的的中性粒细胞和巨噬细胞消融。使用这些消融技术,中性粒细胞和巨噬细胞炎症反应的具体贡献可以切割。

在过去的20年里，斑马鱼已经进化为许多传染病的模型生物，包括细菌、真菌、和寄生虫感染。在这里，我们集中研究吞噬细胞对特定细菌和真菌感染的反应，这些反应揭示了一系列吞噬细胞反应的基本见解，从宿主保护到有害的。我们还讨论了如何在斑马鱼幼体中建立无菌炎症模型，使我们能够更深入地了解炎症过程中调控吞噬细胞定向运动的信号系统。

吞噬细胞在细菌和真菌感染期间的反应

研究感染性疾病和开发新的治疗策略是一项持续的需求，特别是在抗生素耐药性不断增长、医院感染、重复感染和(再)出现新病原体的背景下。在许多情况下，患者依赖适当的先天免疫反应作为第一道防线，特别是免疫缺陷患者。这使斑马鱼成为一个合适的模型，因为在先天免疫和适应性免疫的发育过程中存在时间上的分离。此外，感染挑战可以很容易地传递到斑马鱼幼鱼的不同解剖部位，这取决于所使用的微生物和特定的先天免疫细胞反应。许多重要的研究都利用斑马鱼模型来进一步理解宿主对重要病毒和寄生虫感染的反应。为了这篇综述的目的，我们选择了着重于例子的细菌和真菌感染，说明了吞噬细胞反应的异质性性质。这包括保护宿主的吞噬细胞功能和有害的功能，如促进感染扩散或促进组织损伤。

细菌感染

斑马鱼细菌感染建模对我们理解人类对多种细菌感染的早期先天免疫反应有重大贡献。

专业吞噬细胞在限制细菌生长和根除感染方面起着至关重要的作用。然而，细菌已经进化出不同的策略来延缓或避免吞噬细胞的有效杀伤机制。在接下来的部分，我们关注于斑马鱼对海洋分歧杆菌的反应，并且研究用麻风分歧杆菌、洋葱伯克霍尔德菌和金黄色葡萄球菌来展示吞噬细胞在不同的方法中会保护宿主还是伤害宿主

巨噬细胞对海洋分歧杆菌菌的反应在很大程度上是对宿主的保护

一个典型的例子是，吞噬细胞，特别是巨噬细胞，如何提供宿主保护功能，在结核病样斑马鱼疾病模型中，使用了密切相关的天然鱼类病原体M. marinum。结核病是由结核分枝杆菌(M. Tuberculosis)引起的，是世界范围内一个持续的重大健康威胁，每年仍以惊人的速度成功感染数百万人。长期存在的关于人类结核病发病机制的传统观点在过去十年中受到挑战，使用密切相关的病原体M. marinum，在斑马鱼中模拟结核病样疾病。

肉芽肿是结核的临床特征，是一种高度组织化的结构，其核心是受感染的巨噬细胞，周围有淋巴细胞、坏死细胞碎片(干酪)和纤维化细胞层。肉芽肿通常被认为是一种紧密的屏障和静态结构，它限制了细菌的生长，从而限制了它们的扩散。对海洋哺乳动物感染的斑马鱼幼鱼的细致研究表明，早期肉芽肿样结构可以独立于适应性免疫反应形成，其中分支杆菌主要被巨噬细胞吞噬。这通过招募未感染的巨噬细胞启动肉芽肿样结构的扩张。因此，巨噬细胞的募集依赖于细菌分泌的蛋白ESAT6(由RD1毒力位点编码)，该蛋白驱动被感染巨噬细胞邻近的上皮细胞中基质金属肽酶9的表达。被感染的巨噬细胞会迅速死亡被新到达的未感染的巨噬细胞吞噬，导致M. marine增殖和肉芽肿的细胞扩张。对单个巨噬细胞反应的追踪也显示，一些感染的巨噬细胞离开肉芽肿，通过建立继发性肉芽肿传播感染。最近的一项研究也表明，当巨噬细胞供应变得有限时，肉芽肿会从支持巨噬细胞内分枝杆菌生长的肉芽肿转变为支持巨噬细胞坏死的肉芽肿，并将分枝杆菌排出到细胞外肉芽肿环境。

对斑马鱼的研究也揭示了一些导致巨噬细胞坏死发生的线索，包括促炎症细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)水平的改变。使用吗啉核苷酸对TNF受体进行的瞬时敲除实验能够揭示TNF在衰老过程中的多效性作用，在M.marinum发病时。在本研究中，TNF水平降低导致低炎症状态，伴随分枝杆菌生长增强和肉芽肿形成加速，最终导致巨噬细胞坏死增强，肉芽肿破裂和M marinum的细胞外细胞增生。。令人惊讶的是，当TNF水平过高时也出现了类似的结果。而联合注射重组TNF到海洋分歧杆菌感染的斑马鱼幼鱼最初减少了分枝杆菌的负担，巨噬细胞发生了ripk1 - ripk3依赖性机制诱导的坏死(程序性坏死)，这反过来增强了线粒体活性氧产生。利用化学抑制剂相对容易暴露的斑马鱼幼鱼，研究表明有两条通路可以通过一个细胞器间回路诱导这种活性氧依赖性巨噬细胞坏死。最初，线粒体通过溶酶体酶酸鞘磷脂酶(aSM)激活神经酰胺的产生。神经酰胺，反过来，激活细胞质蛋白BAX，促进钙流过ryanodine受体(RyR)从内质网回到线粒体。钙离子的流入使巨噬细胞线粒体超载，最终导致线粒体基质蛋白亲环蛋白的激活，从而诱导坏死。这种tnf介导的坏死机制被证明是对M.marinum和被结核杆菌感染的人类巨噬细胞保守的机制。这些tnf应答通路的详细分子解剖提供了广泛的潜在的新药物靶点，这些靶点已经在斑马鱼结核病模型中应用和验证。有希望的新疗法包括:亲环素D抑制剂(如Alisporivir)， asm阻断药物(三环抗抑郁药地西帕明)，钙通道阻断药物(LTCC抑制剂，如维拉帕米)，ryr阻断剂(丹曲林)，或ROS清除剂。这些药物中有许多目前正处于临床试验阶段，或已被批准用于治疗其他疾病。除了在结核病进展过程中平衡足够的TNF水平，新的潜在治疗途径还可能包括维持稳定的巨噬细胞数量特别是靶向性巨噬细胞同时加入载药纳米颗粒或脂质体，如利福平。

中性粒细胞在结核病感染中的作用尚不清楚，而研究中性粒细胞在结核病中的作用的哺乳动物体内研究是相互矛盾的，斑马鱼的研究表明中性粒细胞在控制感染方面似乎不那么重要。虽然分支杆菌可以逃避斑马鱼幼鱼中性粒细胞的直接吞噬，但在肉芽肿内被感染的巨噬细胞通过caspase介导的细胞死亡，吸引中性粒细胞吞噬濒死的巨噬细胞。在间接摄取分支杆菌后，中性粒细胞可以通过NADPH氧化酶介导的ROS生成直接杀死细菌。尽管中性粒细胞似乎对控制结核感染并不重要，但感染后期较高的细菌负担已被证明伴有中性粒细胞减少。此外，在分枝杆菌感染之前，通过操纵缺氧诱导因子1 (Hif-1a)信号，中性粒细胞中强制产生活性氮物种，可以诱导宿主的保护。操纵分枝杆菌中性粒细胞逃避策略或HIF-1途径为潜在的治疗干预提供了有趣的新途径。总的来说，这些调查斑马鱼幼鱼对海洋结核杆菌的先天免疫应答的研究极大地提高了我们对结核分歧杆菌发病机制的理解，并揭示了新的机制，可能使有希望的发展新的治疗方法。

巨噬细胞对麻风芽孢杆菌和洋葱伯克霍尔德菌的反应损伤了宿主

与海洋分枝杆菌和结核分枝杆菌的近亲是麻风病，一种导致人类麻风病的不活动细菌。这种细菌在30摄氏度的温度下生长，这使得在哺乳动物模型上进行充分研究变得困难。然而，它使变温斑马鱼成为一种极好的模式生物，其临床症状与人类疾病相当。麻风杆菌感染的一个显著特征是广泛的脱髓鞘神经病变，表现为髓鞘的无序和分解，随后轴索损伤。与其他分枝杆菌一样，最初的感染和复制发生在巨噬细胞中。令人惊讶的是，这种神经系统疾病并不是由病原体本身直接引起的，而是由巡逻的被感染的巨噬细胞引起的。利用共聚焦和透射电子显微镜技术在斑马鱼幼鱼身上证实了这一点。巨噬细胞被证明与麻风病外细胞膜的特定成分，三糖基化酚糖脂1 (PGL-1)相互作用，导致诱导型一氧化氮合酶(iNOS)驱动产生神经毒性一氧化氮。巨噬细胞中活性氮的来源随后导致相邻轴突的线粒体损伤。目前关于感染的巨噬细胞如何到达神经有两种假设:一种可能是通过覆盖的皮肤病变，使巨噬细胞从肉芽肿直接播散到附近的周围神经。第二项研究表明，未被包裹在肉芽肿结构中的感染巨噬细胞从血管渗出，巡逻轴突，这与它们在稳态条件下的行为相似。

后一种假说将支持与其他分枝杆菌疾病相比，麻风病如何表现为如此广泛的神经病变。

与麻风杆菌感染类似，巨噬细胞对另一条件致病菌cenocepacia的反应也可能对宿主有害。大肠杆菌属于洋葱伯克霍尔德菌复合体(Bcc)，可以作为机会致病菌出现，特别是囊性纤维化患者和免疫功能低下的个体。cenocepacia在斑马鱼模型中毒性极强，巨噬细胞对初始感染和复制至关重要。根据感染途径的不同，静脉注射(i.v)或皮下注射(s.c.)，在被感染幼鱼体内的活体成像实验显示，吞噬细胞以不同的方式与cenocepacia接触。如果对cenocepacia进行静脉注射，中性粒细胞和巨噬细胞都被招募到感染部位。然而，只有少数细菌被中性粒细胞吞噬，触发脱颗粒，导致组织损伤和增加细菌负担。在皮下注射感染后，中性粒细胞主要吞噬梭状芽孢杆菌，但未能杀死该细菌。相反，感染的中性粒细胞采用圆形形态，并将细菌喷射回细胞外间隙，这表明非溶性胞吐作用或基于网络的机制无法有效地摧毁B. cenocepacia。

相反，巨噬细胞在静脉注射后主要吞噬细菌，并在皮下注射感染后的后期与小梭菌接触。无论给药途径如何，B. cenocepacia都未能有效地在巨噬细胞耗尽的宿主中复制，从而提高了存活率。这种对生存的影响部分依赖于巨噬细胞来源的111b，它诱导了宿主保护和致命的促炎后果。此外，表达分析显示感染后巨噬细胞和中性粒细胞标记基因mpegl和mpx的整体下调，提示系统性髓细胞通过大规模炎症死亡，通过一种未知的机制赋予感染巨噬细胞特异性的生存优势。在巨噬细胞内复制后，cencepacia在离开巨噬细胞液泡后，利用非溶性逃逸机制感染周围的细胞，导致全身和致命的感染。B. cenocepacia感染提供了一个很好的例子，说明在感染期间吞噬细胞如何表现出不同的反应，此时巨噬细胞加重了疾病

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