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利用甲基丙二酸二乙酯对糖多孢红霉菌突变株的响应型（Dmr）表型改进红霉素工艺

1. Mark Weber*, William H. Cernota, Melissa C. Gonzalez, Benjamin.Leach,Andrew R.Reeves, and Roy K. Wesley

Fermalogic, Inc, 920 North Franklin Street, Chicago, IL 60610

摘要

在油基发酵培养基中，发现具有甲基丙二酰辅酶a突变酶反应阻滞的糖多孢菌属(红霉素B)敲除突变株FL2281，该突变株携带一个甲基丙二酸二乙酯响应型(Dmr)表征。往油基培养基加入15ml的该溶剂，Dmr显型时会使得红霉素A(红霉素)的产量增加250-300％。红霉素产量与溶剂浓度成比例，溶剂浓度越低，红霉素产量越少，而浓度较高时，对其没有作用。尽管mutB菌株在表型上是低水平红霉素产生菌，但加入甲基丙二酸二乙酯使其产生的红霉素比野生型(对照)菌株多30%，并且野生型(对照)菌株没有表现出Dmr表型。Dmr表型代表了一类新的菌株改良表型。本文提出了一种解释Dmr表型生化原理的理论。其他存在生长缺陷和色素沉着的表型与缺少mutB有关，均通过与甲基丙二酸二乙酯接触而恢复正常。此外，在存在甲基丙二酸二乙酯的情况下，mutB发酵对大豆油没有显著的代谢作用。最后，本文提出了分离一种具有Dmr表型的附加突变体的新方法。

关键词

甲基丙二酸二乙酯，红霉素，mutB，甲基丙二酰CoA变位酶，Dmr，糖多孢红霉菌

引言

聚酮类抗生素红霉素A(红霉素)是由一种阳性的、菌丝的、土壤中的放线菌产生的。这种细菌广泛用于聚酮生物合成的研究(Rawlings 2001;Kwan 等人. 2011)和改善品种(Wu 等人. 2011;Chen等人2010;Wang 等人 2007);其基因组已被完全测序和标注(Oliynyk 等人. 2007)。虽然红霉素自20世纪50年代以来一直作为抗生素使用，但现在主要用作活性药物成分(API)，用于生产几种半合成品红霉素衍生物，包括阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素和罗红霉素。制造商需要通过菌株或工艺改进来降低红霉素生产的成本，或者通常是两者的结合。这一点现在尤为重要，因为半合成品红霉素很快就会进入仿制药市场，因此降低生产成本对商业成功至关重要。

红霉素是发现抗生素的黄金时代中的抗生素之一，如今可用的大多数可用的畅销菌株都是通过经典的菌株改良技术改良的(Queener和Lively.1986)。传统的方法涉及随机突变的试错产生，通常在成千上万次军菌株中找到一个能产生更多红霉素的菌株。随着时间的推移，可以发现经典方法在频率和次数上的改进。因此，更新的的代谢工程菌株改良方法一直在研究中(Keasling 2010)。一些在开发中的新工艺便是利用大肠杆菌 (Pfeifer等人. 2002; Boghigian等人. 2011; Zhang等人. 2010; Weber 2010)和链霉菌(Lombo 等人. 2001)的异体系统，或者单细胞微氧菌(Brikun等人. 2004; Miller 1991)和菌丝斑疹杆菌(Minas 2005;Reeves等人，2007)的本体系统。与此同时，目前的大规模发酵仍然使用传统改良的S.红霉素菌株作为生产菌，使用由豆粕、大豆油、淀粉等农业成分混合而成的发酵培养基。

本研究采用的方法是带有S. 红霉素的一种工艺改进，以补充mutB遗传株为改进目标(图1)。之前的遗传实验表明，红霉素的生产受到聚酮前体甲基丙二酰辅酶a (CoA)的限制。那个时候，在其他聚酮类天然产物也有类似的发现(Mo 等人. 2009)。我们的结论是从mutB敲除株中推断出来的，甲基丙二酰辅酶a突变酶(MCM)在甲基丙二酰辅酶a和丁二酰辅酶a反应中被丙酸盐反应阻断(图1;Reeves等人，2006)。这种突变因而阻止了聚酮前体从三羧酸(TCA)循环进入聚酮合成酶(PKS)。这种阻断导致红霉素在油基培养基中产生的量显著减少(40 - 65%)(为Reeves等人研究，2006年)。因为在过去是通过基因操作提高红霉素的产量，这使得甲基丙二酰辅酶a (CoA)向聚酮合成酶的转变增加(Reeves et al . 2006, 2007），该研究调查预测,直接添加甲基丙二酸单酰辅酶a关联化合物到发酵培养基也可以增加产量。

由于细胞酯酶的普遍存在，预测其会直接进入与丙酸盐反应阶段，所以甲基丙二酸二乙酯被预选为甲基丙二酰辅酶a关联化合物。这也是基于其能否用于其他工业过程以及能否容易大量获得的选择。甲基丙二酸二乙酯的另一个优点是，它可溶于红霉素发酵培养基的油组分，因此不会像丙二酸二甲酯那样降低水培养基的pH值。甲基丙二酸二乙酯的价格比丙二酸二甲酯便宜2 - 3倍，因此在大规模发酵中使用它将会更经济有效，特别是低浓度时将会更有效。

本文报道了甲基丙二酸二乙酯与糖多孢红霉菌株联用的益处。同时还讨论了一种改进传统菌株改良方法的新策略，使商业菌株在现有生产平台的基础上得到改良。

1.材料和方法

1.1菌株，培养条件，化学和生物化学品

本研究中使用的两株糖多孢菌属的菌株分别是野生型FL2267和mutB极性敲除菌株FL2281 (Reeves等人. 2006)。两个菌株都是糖多孢红霉菌ATCC 11635菌株的衍生物。FL2281中甲基丙二酰辅酶a突变酶的敲除是由突变体中卡那霉素耐药基因的插入引起的(Reeves 等人. 2006)。红霉素A、B、C均来自美国药典99%纯由红霉内酯(EB，99%纯度)和3-O-碳霉糖基红霉内酯(MEB, 99%纯度)是由Fermalogic, Inc.所生产 。发酵采用每升含1-2倍淀粉的发酵液(含2倍淀粉的油基发酵培养基):烤营养粉(ADM,Decatur, IL)， 22克;DifcoTM可溶性淀粉，30克;CaCO3粉(JT Baker, Phillipsburg,NJ)， 3g;MgSO4.7H2O (JT Baker) 0.5 g;FeSO4 7H2O (JT Baker)， 15 mg;大豆油，50ml (ADM)。99%甲基丙二酸二乙酯(溶剂)从Sigma-Aldrich (St.Louis, MO) 获得，经高压灭菌后加入培养基中。将64ul的甲基丙二酸二乙酯和25ml的液体培养基和1.25ml的大豆油瓶装入250ml的摇瓶中并补充到15mM的水平。

1.2发酵、生物测定、生长、油的利用和薄层色谱法

本研究中使用的发酵、生物测定和薄层色谱法(Reeves等人. 2006)已经有过描述。摇瓶发酵分为3组用于红霉素生产(图2)，重复(图3)。在250ml摇瓶中每瓶装25ml发酵液，用于制备薄层色谱，点样三种发酵提取物中的两种。样品拿去在贝克曼模型Phi;34酸度计中测量PH值，并进行三次发酵的平均值计算。培养黏度以目测为依据:低(含水)1分，中(含水)2分，高(含水)3分(图2和图3)。相对细胞颗粒大小用于估算生长(图3)，油层厚度用于估算油的利用率。在15毫升锥形试管中对培养液样品离心后，分别测量了颗粒和油层。

1.3甲基丙二酸二乙酯对红霉素生物转化效率的计算

甲基丙二酸二乙酯在15mM浓度水平对红霉素A的生物转化效率是计算由红霉素生产的数量所决定的，由加入甲基丙二酸二乙酯时红霉素的含量 1.4g/L

(图.2B, 15 mM)减去不含甲基丙二酸二乙酯时红霉素的含量0.52 g/L(图2B, 0 mM DiEMM控制)，它们之前有着0.88g/L的差值。转换成毫摩尔为单位，以0.88 g / L除以734 g / M(红霉素A)得分子量为1.2mM。假设每摩尔的红霉素A使用7mol甲基丙二酸二乙酯，则15mM/7=2.14mM。因为2.14mM的7聚体甲基丙二酸二乙酯可以制得1.2mM的红霉素A，这代表着摩尔生物转化率为1.2/2.14，为56％。

2.结果

2.1甲基丙二酸二乙酯补充了野生型S.红霉素菌株(FL2267)

为了观察野生型菌株受甲基丙二酸二乙酯的影响，选取三组浓度范围在0-25mM内的甲基丙二酸二乙酯补充到油基培养基（含1-2倍淀粉）中进行摇瓶发酵，经过5天的红霉素培养后，分析浓度、PH值、粘度和存不存在单糖基红霉素前体(EB或MEB分别)。

结果表明，没有补充时，野生型发酵产生的红霉素平均为790mu;g /ml(SD = 32mu;g /ml)。随着补充量增加，产量略有上升(图2A，顶部)。定性TLC分析(图2A中)显示，甲基丙二酸二乙酯导致非生物活性、非糖基化的红霉素前体EB的积累。然而，据推测并非所有的甲基丙二酸二乙酯都转化为EB，因为EB斑点的强度没有上升到超过15mm的水平。补充量不影响培养物的pH值，但粘度(第5天测定)在各个水平上都得到了改善。

2.2甲基丙二酸二乙酯突变体补充了S.红霉素mutB菌株(FL2281)

与野生型菌株一样，FL2281突变株在发酵开始时加入浓度范围为0 ~ 25mm的甲基丙二酸二乙酯在1-2倍淀粉发酵液中进行三次重复发酵培养。

结果(图2B)显示，补充甲基丙二酸二乙酯对5、10和15 mM水平的红霉素的产生有很强的积极影响。在15mM的级别时，mutB发酵从0mM时产量为520mu;g /ml(SD = 38mu;g /ml),上升到平均1395mu;g /ml(SD = 58mu;g /ml)，这代表红霉素的产量增加250%以上。比较突变体和野生型菌株，两种菌株在最高产的条件下生长(突变体15 mM，野生型5 mM)，突变体比野生型多产生30%以上的红霉素。在15mM的浓度时，每25ml的培养基(0.25% v/v)只需要64ul的甲基丙二酸二乙酯，使得红霉素大量增加。这表明甲基丙二酸二乙酯对红霉素的摩尔转化率高达55%以上(材料和方法)。

mutB敲除株未积累或者没有单糖基红霉素前体(MEB或EB)，直到补充量达到15mM，单糖基前体MEB才开始积累。在20mM和25mM浓度下，EB和MEB均有积累。

可以看到补充甲基丙二酸二乙酯达到20-25mM（图2B）时，会对红霉素的生产产生较强烈的负面影响，结果表明，更高浓度的甲基丙二酸二乙酯对mutB突变菌株可能有毒性,或抑制红霉素生产,或两者兼有。为了解决mutB菌株的这一问题，我们进行了一项实验，每天以小剂量(5mM)加入甲基丙二酸二乙酯，而不是在发酵开始时大剂量加入 。结果(图2C)显示，低浓度的甲基丙二酸二乙酯每日多次给药只能提高25mM级别的发酵产率——在低浓度的甲基丙二酸二乙酯级别下没有任何益处。

2.mutB和Dmr敲除株FL2281的相关表型

通过在有或者没有DiEMM补充的情况下，每隔24h对在含量为1-2倍淀粉中mutB菌株的发酵做对照，为期6天(Fig. 3) ，通过这来研究添加甲基丙二酸二乙酯对红霉素产量和其他表型的影响,包括生长、粘度、成色、油基的利用率。在培养基中加入甲基丙二酸二乙酯后，突变体mutB菌株的生长缺陷和粘度恢复正常(图3E和F)，这种现象在第2、3、4天特别明显(图3G和H)。

添加甲基丙二酸二乙酯对培养色素着色也有显著影响。FL2281发酵在第2天着色为红色，在随后的时间点变为暗灰-绿色(图3G)。然而，添加了甲基丙二酸二乙酯的FL2281培养物除了正常的健康野生型菌株特有的琥珀色外(图3H)，没有色素沉着的迹象。最后，添加甲基丙二酸二乙酯降低了培养基中豆油的消耗量，未添加使得培养基中大豆油层在五天发酵结束时被完全耗尽。添加后的培养基油层变得混浊，但厚度没有明显减少，说明在整个发酵过程中，油层的代谢并没有保持不变(图3G和H)，如上所述，添加后可显著提高红霉素的产量。添加的在第五天时突变体mutB的峰值超过300%以上的最大生产水平的生产菌株（M = 1480mu;g /ml,SD = 36mu;g /ml),而未添加的突变体mutB的峰值水平在第6天(430mu;g /ml,SD = 235mu;g /ml)。(图3A和图B)。

3.讨论

3.1红霉素菌种及工艺改进

在以往的研究中，基因实验表明甲基丙二酰辅酶a是生物合成红霉素的限制因素(Reeves 等人. 2004,2006,2007);因此，在本研究中，我们进行了实验，看看直接添加甲基丙二酸二乙酯是否可以改善红霉素发酵。

图2和图3的结果表明，突变株FL2281在添加甲基丙二酸二乙酯后有明显的反应，产生了更多的红霉素。突变株响应甲基丙二酸二乙酯的表型（Dmr）在15mM时作为两个独立实验测定时，其红霉素产量分别增加了250％（图2）和300％（图3）。250％的增加代表着甲基丙二酸二乙酯转化成红霉素(材料和方法)为55％摩尔/摩尔转换效率。与之形成鲜明对比的是，野生型菌株FL2267在与甲基丙二酸二乙酯的反应中并没有产生更多的红霉素。由于突变株自然产生的红霉素比野生型少约40%，因此甲基丙二酸二乙酯不仅使突变株达到了野生型的产量水平，而且使其产量水平提高了30%。接下来讨论了突变株如何使用甲基丙二酸二乙酯来实现这一改进。

从野生型菌株开始，在未添加的1-2倍淀粉培养基中，结果(图2A)显示，甲基丙二酸二乙酯没有转化为红霉素，表明聚酮前体库不是(唯一)限制因素。因此，野生型菌株的模型显示了一组摩尔平衡的前体库，导致红霉素的产生(图4A)。在这种情况下，没有一个前体是有机限的，所以所有的前体池需要一起提高，使得应变得以改善，需要同时提高所有前体库的全球突变的突变类型，并且很可能已经被纳入经典生产的商业菌株。当在野生型菌株中添加甲基丙二酸二乙酯时，它只是进入聚酮合成酶(PKS)，使菌株产生更多的聚酮中间体EB(图4B)。即使是将最低水平的甲基丙二酸二乙酯添加到培养液中，也能在野生

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