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青黛在溃疡性结肠炎多中心随机对照试验中的疗效

背景和目的：青黛是一种含有芳烃受体的配体的传统中药，能通过诱导白细胞介素22的产生促进粘膜再生。青黛能诱导粘膜治愈溃疡性结肠炎（UC）患者。我们进行了随机性对照试验来研究青黛治疗UC患者的安全性及有效性。

方法：我们设计了一个多中心双盲试验评估86名日本从2016年三月23到12月27登记的携带活性UC患者（Mayo评分六及以上）的安全性。病人被随机分组成每日青黛剂量为0.5g、1.0g、2g或者安慰剂（1:1:1:1比例），持续八周。主要终点是第八周的临床反应率，定义为梅奥分降低三分，相比基线至少降低30%，即直肠出血分项降低至少1点或直肠出血绝对评分为0-1。主要次要终点为第八周的临床缓解率，定义为梅奥分小于等于2且没有分项分数值大于1.粘膜愈合也在第八周进行评估。

结果：该试验由于一个外部原因终止：一个使用自购青黛六个月的病人报告发生肺动脉高血压。在意向治疗分析中，我们观察到一个显著的、剂量相关的线性比例趋势出现在有临床反应的患者中（13.6%对安慰剂有临床反应，69.6%对服用0.5g青黛有临床反应，75.0%对服用1g青黛有临床反应，81.0%对2g青黛有临床反应）（CA趋势检验Plt;0.001，与安慰剂比较）。在第八周，1.0g青黛组(55.0%, P frac14; .0004)和2.0青黛组(38.1%, (P frac14; .0093)的病人临床缓解率比例明显高于安慰剂组（4.5%）。安慰剂组患者粘膜愈合率的比例为13.6%，0.5g青黛组为56.5%，1.0g青黛组为60.0%，2.0g青黛组为47.6%（P frac14; .0278相比于安慰剂）。虽然在10例接受青黛治疗的患者中发现了轻度肝功能障碍，但没有严重的不良反应出现。

结论：通过一个随机的安慰剂对照试验，我们发现八周的青黛（每天0.5-2.0g）对UC患者在诱导临床反应中有效。然而，青黛目前还不应该被使用，因为存在潜在的副作用包括肺动脉高血压。临床试验注册中心：UMIN000021439(http://www.umin.ac.jp/ctr/)。

溃疡性结肠炎(UC)是一种以腹痛腹泻、大便粘稠/带血为特征的慢性炎症结肠疾病。随着UC免疫生物治疗学的最新进展，受影响的病人情况得以改善。主要针对被激活的细胞的生物制剂和免疫抑制剂对难治的病人是很有效的治疗方法，像类固醇耐受性差的病人和激素依赖型UC患者。然而，即使是最先进的抗炎药也不能有效治疗粘膜再生受到干扰的棘手的案例。因此，一种针对粘膜再生的使用新机制治疗UC的方法急需研究。

目前，靛玉红（IN）(也被称为青黛)已被用于治疗各种炎性疾病，主要在中国。青黛是一种来自靛蓝植物的中草药，自古以来被用作蓝色染料。青黛似乎在六十年代中国被用于治疗UC，但只有一点关于青黛用于治疗UC的英文研究被发表。基于青黛临床疗效的明确机制还没有被充分地证明。然而有趣的是，青黛的主要成分最近被表明是一种人类芳烃受体的配体，通过芳烃受体表达的先天性淋巴细胞（ILC）能促进IL-22的产生。像IL-10一样，IL-22的半衰期很短，这代表着重组IL-22治疗用于临床试验发展的关键问题。因此，青黛可能作为一种IL-22的诱导剂，促进难治性UC患者粘膜再生。

Suzuki等人的回顾性研究表明，青黛在治疗UC患者中展示了显著的临床和内镜治疗效果。最近，我们在一篇前瞻性研究中报道了青黛治疗传统治疗方法难以治疗的UC患者，大约70%的患者在治疗八周内表现出临床症状。值得注意的是，在观测AhR配体的可能机制时，大约60%治疗后八周内使用青黛的患者检测到粘膜愈合。然而没有双盲、剂量递增的试验报道过青黛是有效性，且青黛的合适剂量尚不清楚。

在这个多中心、随机、双盲、安慰剂对照研究中，我们依据剂量的依赖性反应评估了青黛的有效性和安全性。另外，我们也试图评估青黛治疗是否缓解了肠道失调。

方法：

研究设计：研究方案包含在补充附录中。这个前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照试验在日本的21各医疗中心进行。该方案在各个机构中得到了国家卫生和计划委员会的审查和批准。所有病人在研究启动前提供填写书面知情同意书，依照赫尔辛基宣言。本研究预先在大学医疗机构网络中心注册（UMIN临床试验注册，编号UMIN000021439;可在http://www.umin.ac.jp/ctr/查看)。所有作者可以获得研究数据并检阅，并同意了最终的手稿。

参与者:根据日本卫生部健康劳动福利组织炎症肠病研究组规定，符合条件的患者年龄至少16岁，且梅奥得分6分及以上（范围0-12分，分数越高病越严重）和乙状结肠镜检查至少2分。如果患者患有严重的多发性硬化症，则被排除在研究之外，炎症目前仅存在于直肠，患者有结肠相关发育不良或症状，肠道狭窄，如果他们有其他类型的结肠炎（如传染性结肠炎或缺血性结肠炎）。UC的患者也被排除在外。规定的协议中还描述了其他的排除标准（见补充附录）。

筛选及研究程序：患者的人口学资料和疾病特征在随机化之前在每个机构收集。病人在随机化前一周接受了结肠镜检查。内窥镜下疾病活动程度由训练有素的内镜医师监测并根据梅奥内窥镜分数评分。内窥镜检查主要由现场调查人员评估。一份诊断性内窥镜中央审查是盲目的临床资料，并被现场调查人员独立执行来确保评估的准确性。临床疾病活动由训练有素的医生根据梅奥分数、修改后的Truelove评分及Witts严重指数（MTWSI）评定。粪便样本在干预前三天以及干预的第八周从每位患者处获得；粪便蛋白水平被检测（Thermo Fisher Scientific，东京，日本），粪便免疫化学验血（LSI日本有限公司，东京，日本）就临床和内镜资料而言以一种盲目的方式进行。病人至少在第0、2、4、8周进行检测，每次检测部分的梅奥评分将会被评估（不包括内镜评分。范围0-9）。每个机构都进行了血液检测，包括白细胞计数，血红蛋白水平，红细胞压积，血小板计数、血清蛋白、白蛋白、总胆红素、总胆固醇，AST, ALT，碱性磷酸酶，gglut淀粉酶，淀粉酶，尿素氮，肌酐，葡萄糖和c反应蛋白水平。不良事件和伴随的药物治疗记录每次拜访时都会被记录。结肠镜检查严重性采用常规白光成像(Olympus医疗系统，日本东京或Fujinon Toshiba ES系统，日本东京)。现场调查人员评估和确定了影响最严重的部位是乙状结肠肛门，通过第0周和第八周相同位置的评测。第0周和第8周捕获的图像被发送给诊断内镜中心审核员。审核员保证了由现场评估人员调查的可靠性。协议委员会规定了本研究终止的标准作为严重问题的澄清，像质量保障、青黛治疗的安全性、招募参与者的困难性和来自道德委员会的建议终止。委员会还定义了每例患者的停药标准为UC病情加重（梅奥的部分评分至少从基线提高了三分），严重不良反应的发生情况，和由于UC病情恶化需要手术治疗或者无法持续治疗四天以上或两天以上超过一次的病例。

干预：同批青黛粉剂（中国，福建省）购买自Uchidaw akanyaku, Ltd（日本，东京）。在粉末状青黛加入胶囊前，会进行灭菌处理。多残留农药分析也进行了，且没有农药残留（北陆环境科学研究所，福井、东京）。青黛中的化合物经过定量分析，见补充表1。青黛在2016年1月在日本东京食用品工业有限公司被加入到盲囊中（每个胶囊250mg、125mg或62.5mg）。糊精与上色物质(颜色与粉末状的青黛类似)被添加到胶囊中，用作胶囊安慰剂(补充图1)。青黛和安慰剂均无臭，且外部独立机构（EPI日本有限公司）证实这些胶囊无法区分。患者每天服用4粒青黛，一天两次，持续八周。

随机化和致盲：随机化是通过计算机生成的随机化程序(Mebix有限公司，东京，日本)。在随机化之前，调查人员或联合调查人员输入数据，包括年龄、性别、梅奥评分和内窥镜得分，使用计算机系统的标准确认纳入和排除。病人被随机分到四组中的一个，按1:1:1:1的比例，积极治疗组接受安慰剂或者每天0.5g、1.0g、2.0g的青黛。随机化使用块大小为8执行，由外部独立结构的随机化程序(EPI日本有限公司)进行。

患者和评分者(内科医生)不知道整个研究过程中治疗组的分配。在医疗系统机构（日本，东京）实现了隐蔽分配，分配时间表由EPI日本株式会社提供直至临床数据最终确定，激光目标指示器被隐瞒。在所有数据都被送给统计学家后（临床和转化生物统计学中心，庆应医药大学，日本，东京），数据代码键被打开（2017年3月6号）,激活数据分析。

成果：主要疗效终点为治疗八周后（最后一个调查点）的临床反应率。临床反应被定义为梅奥分降低3点，评分较基线降低至少30%，直肠出血分值降低至少1点或绝对直肠出血评分为0-1。主要的二级终点为八周治疗的临床缓解率（最后一个调查点）。临床缓解定义为梅奥得分r2 gt;1和任何部分分值＞1。粘膜的愈合率也在八周治疗后被评估。梅奥内窥镜评分通过评估每个人最严重的部位来决定，分数在八周治疗后相同部位也被检测。粘膜愈合定义为梅奥内窥镜评分为r1。另外，梅奥分、部分梅奥分、内窥镜评分、MTWSI、反应蛋白水平和血清蛋白水平的连续变化通过比较第2、4、8周收集的数据相比基线值来决定。第八周粪便钙卫蛋白水平＜150mg/g和定量的粪便免疫化学血液测试＜100mg/ml的部分患者也会在四个组中被比较。

安全性评估，包括所有不良事件报告，青黛治疗和不良事件中直接因果关系的明确指示以及临床实验室测试，在整个研究过程中被评估。肝功能异常定义为在任一一次拜访的检测中AST或ALT水平超过上限的情况。

收集粪便样本进行测序和细菌16S rRNA基因的处理

粪便样本在治疗前和八周治疗后从在庆应大学医院登记的患者处收集。细菌DNA按之前描述的方法描述。在MiSeq Illumina平台上进行了多路16S扩增子测试。详细的方法在补充附录中说明。本研究分析的所有高品质16S V1-V2序列被存放到登录号DRA00005811下的DDBJ/GenBank/EMBL数据库中。

给健康对照组的公开可用的元基因组序列数据

我们从最近的一项研究中收集了健康日本人的宏基因组序列数据。我们选择并使用了104例未患代谢性疾病的健康人作为健康对照组。这些宏基因组序列在登录号PRJDB3601下登记在DDBJ中。

样本大小：临床反应率，即八周后符合主要疗效终点标准的患者(即应答者)所占比例，估计在积极治疗组(每天0.5、1.0或2.0 g青黛)检测为70%，安慰剂组为30%。每组24例患者要求达到80%的效率，与在最高剂量（2.0g）组和双侧5%阿尔法的安慰剂组有效率相比。这次计算在初级分析（趋势测验）中被用作近似值。基于初级分析20%的退出率，计划每组招募20个患者。

数据分析：主要功效在意向治疗（ITT）人群（nfrac14;86）中分析。在意向治疗人群中，由于人为错误造成的计算机系统未经资格验证的错误随机化分配的情况被排除在分析外。此外，该临床试验由一个外部原因而终止：报告一个可能存在肺部不良事件动脉性高血压（PAH）的UC患者使用自己购买的青黛六个月，在2016年12月被卫生劳动福利组织警告。首席调查员决定在2017年1月13号终止试验，确保参与者的安全。七个因为终止而停止这次研究的患者包括在ITT分析中。

安全分析包括的人群由所有接受至少1剂量（4粒）研究药物的随机病人组成。人口因素和基线特征由各治疗组统计来评价各治疗组间因素的不平衡。

对于主要疗效终点，临床反应率和符合标准的病人的比例，用科克伦-阿米蒂奇线性趋势测定 (线性对比:-3、-1、1、3) 检验线性趋势。当双侧5%的alpha的水平对初级测试很重要，每一剂安慰剂成对比较都是用封闭的测试程序(见补充附录中统计分析计划)。主要终点，达到临床反应的病人比例，当内窥镜中央审查员独立评估作为敏感性分析的梅奥内镜评分时也会被评估。

对于梅奥分数的纵剖面，部分梅奥评分、实验室结果和八周的基线值变化通过使用重复测量的混合效应模型在治疗组中比较。这个模型包括治疗组，每周和每周治疗作为固定效果，和一个包含患者的表现出复合对称性的协方差矩阵。对误差方差的自由度进行Satterthwaite调整后应用。所有统计分析均采用SAS版本9.4 (SAS Institute Inc, Cary, NC)进行。所有测试的显著性水平都是双面值5%。

结果：

随机化和患者在基线状态的临床特征

在提供知情同意的91名患者中，有5人患者要么不符合纳入标准，要么符合排除标准。从2016年3月30日到12月27日，共86例患者加入，并进行了适当的随机化处理。研究流程图如补充图2所示。最后，22例患者接受了安慰剂治疗，23例，20例，21例每天服用分别为0.5 g、1.0 g和2.0 g 青黛。四组(Pfrac14;.1641)(表1) 整体病程分布无显著差异。安慰剂组和0.5g青黛的入组平均年龄的比1.0 g和2.0 g青黛组(Pfrac14;.0692) 的含量更高比较组内其他因素均无统计学意义。

临床疗效

对于主要终点，第八周的临床反应率，青黛呈显著的剂量依赖性线性趋势(图1，补充表2;安慰剂,13.6%(3/

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