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Reduced Silver Nanoparticle Phytotoxicity in Crambe abyssinica with Enhanced Glutathione Production by Overexpressing Bacterial gamma;‑Glutamylcysteine Synthase

通过过量表达细菌gamma;-谷胱酰半胱氨酸合成酶增强谷胱甘肽产生，减小海甘蓝中银纳米粒子毒性

摘要：

银纳米粒子广泛用于消费品，并且它们的释放引起了关于它们对环境和人体健康的风险的严重担忧。然而，哪种植物可以中和NP毒性的生化机制在很大程度上是未知的。我们之前设计了海甘蓝植物表达细菌gamma;-谷胱酰半胱氨酸合成酶（gamma;-ECS）来增强谷胱甘肽含量（GSH）。在本实验中，我们研究是否增强谷胱甘肽含量及其衍生物可以保护植物免于Ag NPs和AgNO₃（Ag ）。我们的研究结果表明转基因株系和野生型（WT）植株相比，接触Ag NPs和Ag 时，显然更耐受，生物量高28-46%，叶绿素含量多34-49%，并且蒸腾速率高35-46%。转基因gamma;-ECS株系芽中Ag积累量是野生型植株的2-6倍，根中Ag积累量比野生型植株稍低或几乎没有差异。gamma;-ECS株系中MDA的含量也比野生型低27.3-32.5%。这些结果表明GSH和相关多肽保护植物免于Ag纳米毒性。就我们所知，这是第一篇直接报道Ag NP在转基因植株中可以被GSH解毒，并且这些结果对于发展对策来中和基于金属的纳米粒子对作物的生理毒性是十分有用的。

1. 引言

纳米技术已应用在多元化的工业中，包括药品、化妆品、电子产品、农业。众所周知，在纳米尺寸（小于100纳米），材料的物理化学性质可以改变，这一变化大部分由较高比例的表面积引起。许多独特尺寸依赖特性的实用性推动了纳米技术的指数级增长。然而，对纳米材料运输和环境效应认识不足。一些最近发表的研究表明，纳米粒子对植物、微生物和动物可能具有毒性。显然，进一步了解纳米材料使用和接触的风险是必要的。

Ag NPs是消费品中最广泛使用的纳米材料，很大程度上是因为它的抗菌活性；同样，关于Ag NPs对非靶标生物群影响的担忧也在提升。

纳米粒子的毒性机制仍然不清楚，但是由于增加的反应性以及小粒径，纳米粒子能进入植物细胞并积累是十分有意义的。很多人证明Ag NPs在很广的浓度范围可以造成氧化应激，导致产生生理毒性，尽管0.01到0.1 mg/L低剂量的Ag NPs可以促进拟南芥生长。AgNPs

在剂量10-1000ppm范围内，对于番茄、玉米、夏南瓜会抑制种子萌发，根伸长，生物量和生长和蒸腾速率。接触银纳米粒子（20和100纳米）14天，浮萍对剂量呈线性关系。接触剂量增加，浮萍的叶数和相对生长速率显著降低。绿豆与高粱琼脂和土壤条件下评估银纳米粒子的药害，有趣的是，银纳米粒子在土壤药害明显少，大概是在自然颗粒媒介中生物利用度低。值得注意的是，大多数的NP毒性数据仅限于生理终点，这几项研究已经解决了在分子水平上的毒性。Kaveh等人表明thalianol生物合成途径所涉及的转录（一种植物防御机制）在银纳米粒子处理的拟南芥中高度上调。Panda等人介绍了纳米银对洋葱的毒性相比其他银的形式，并指出，NPS通过诱导活性氧引起细胞死亡和DNA损伤。

海甘蓝，是拟南芥的一员，对非生物胁迫如冷、盐、以及重金属有天然抗性。海甘蓝是一种高生物量，高油含量（35-40%）作物，生命周期短，使其成为理想的工业作物用于生物燃料生产和植物修复。先前，我们设计海甘蓝过量表达大肠杆菌gamma;-谷胱酰半胱氨酸合成酶（gamma;-ECS）基因，和野生型相比产生了更多的谷胱甘肽（GSH）。

普遍认为GSH是活细胞中的一种最重要的氧化还原缓冲剂，用于氧化应激和在应激条件下高ROS水平及产生所引起的损伤的解毒作用。在本实验中，两种独立的gamma;-ECS转基因海甘蓝株系暴露于Ag NPs和Ag ，评价基因修饰的海甘蓝对NP和离子态的Ag的潜在抗性。检测的生理参数包括生物量，蒸腾速率，叶绿素含量，还有地上地下部分Ag含量。此外，从毒性和抗性的视角，评估了三种主要的硫醇化合物，涉及整个GSH代谢途径（伴随可溶性营养元素）。就我们所知，本研究是第一篇报道纳米毒性对基因工程植物的生理和生化影响。

1. 材料和方法
2. 种子灭菌：选择表现出较高的转基因表达的两种转基因株系（gamma;-ECS1和16）用于研究。gamma;-ECS16比gamma;-ECS1表现出较高的gamma;-ECS转录表达水平以及gamma;-ECS蛋白水平。野生型和两种独立的纯合转基因海甘蓝株系的种子用70%乙醇表面消毒10 min，两次浸泡在25%的商业漂白溶液15 min，然后用高压蒸汽处理的去离子水洗涤5次，冲洗5 min。种子接种于半强度的MS培养基中，22℃培养，光暗时间比16 h/8h，光照强度250 mu;mol m^minus;2s^minus;1。
3. 抑制的Ag浓度测定：进行初筛选来表示毒性的剂量依赖性，并且能测定最适Ag暴露浓度用于附加的生理和生化研究。Ag NPs初始浓度为25,50,100,200 mg/L（粒径20 nm），Bulk Ag浓度为500,1000,2000,3000 mg/L（粒径44 mu;m），Ag 浓度为25,50,100,200 mu;M。Ag NPs两次超声处理每次30 min使其分散，室温下储存在暗处过夜。Ag NPs在去离子水和Hoaglandrsquo;s 溶液中的水动力学直径用动态光散射（DLS）(Figure S1 in the Supporting Information)测量。对于每个实验组，每盒15颗野生型海甘蓝种子种在Ag修饰的1/2MS培养基。所有实验组都进行三组重复。这些盒子放在生长室超过25d，优先进行生物量测量。

基于初步的剂量应答实验(Figure S2 in the Supporting Information)，200和250 mg/L被选为Ag NP暴露浓度，Ag 浓度为200和250 mu;M。然而，与Ag NP和Ag 相比，在bulk Ag实验组中没有发现生物量的明显差异（甚至在3000 mg/L暴露剂量）。因此，本实验附加实验排除bulk Ag实验组。用同一暴露条件，野生型和转基因海甘蓝接触Ag 25天。

3）在水培系统中Ag NPs对海甘蓝的生理毒性。为测定Ag暴露对蒸腾作用和金属吸收的影响，我们在含有植物凝胶的1/2MS培养基的盒子中萌发野生型和转基因型海甘蓝。25天后，植物小心从固体培养基中移出，然后轻轻地用去离子水冲洗去除根上附着的培养基。野生型和转基因型海甘蓝都转移到半强度Hoaglandrsquo;s 溶液适应7天后，暴露于Ag NP和Ag 实验组5天(Figure S3 in the Supporting Information)。蒸腾作用通过溶液体积的失去测量；每天加入新鲜的不含Ag的溶液维持同一体积。在暴露后，收获植物组织来评价Ag含量，GSH和营养水平。

4）叶绿素含量测定：50毫克的新鲜组织标本，切成片（小于1厘米），加至15毫升离心管中，用10毫升95%乙醇浸提。被测管在黑暗中保存3minus;5天，测吸光度。

叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量由以下方程确定：叶绿素a= 13.36A_664.2 minus;5.19A_648.6; 叶绿素b = 27.43A_648.6 minus; 8.12A_664.2; 总叶绿素含量 =叶绿素a 叶绿素b

1. 海甘蓝中Ag积累和营养吸收测定：收获的跟组织用去离子水冲洗三次以去除表面残留的Ag。所有的根和芽样本65℃烘3天，然后将30 mg组织转移到15 mL加了3 mu;L HNO3的离心管中。样本在室温下消解48 h。然后加入500 mL H2O2到样本中完成组织消解。消化物用去离子水稀释35倍，再用ICP-MS测Ag含量。Ag NPs- 和 AgNO3-修饰的1/2Hoaglandrsquo;s 溶液在5000 rpm下离心1 h。上清液通过0.45 mu;m过滤器过滤，然后用于Ag含量测定。

对于可溶性营养组分的提取，200 mg芽和根样本在1 mL 5%高氯酸（PCA）中提取。样本再冷冻解冻三次，保持在-20℃冷冻直到分析。对于营养定量，PCA提取物稀释100倍，用ICP-AES分析。对所有样本，每20个样本重复标准曲线，并在每次再校准和每10个样本后检查标准运行。

6）海甘蓝脂质过氧化反应测定：脂质过氧化作用通过检测海甘蓝根和芽样本中丙二醛（MDA）含量来测定。

7）海甘蓝中半胱氨酸，gamma;EC，GSH和植物螯合肽水平测定：约200 mg新鲜组织（根和芽样本的均匀混合物）收集在含有1 mL提取缓冲液（6.3 mM 二乙基三胺五乙酸，DTPA，和0.1%三氟乙酸，TEA混合）的1.5 mL EP管中。提取物用于硫醇化合物（半胱氨酸，gamma;EC，GSH和植物螯合肽3（PC3））的衍生和分析。

8）数据分析：每组实验，平均值由4-5组重复平均，误差棒与平均值的标准误差一致。

单向方差分析，然后用一个邓肯多重比较检验来确定各处理间参数的统计意义。各检测值

明显不同（p小于等于0.01或0.05）。

1. 结果与讨论

3.1 Ag暴露海甘蓝鲜重分析

转基因gamma;-ECS和野生型植株暴露在200、250mg/L Ag NPs和200、250 mu;M Ag 。在25天的Ag暴露后，野生型和两种独立gamma;-ECS转基因海甘蓝株系的生物量（根和芽）收获测定。空白对照中野生型和转基因型植株的生物量没有明显差异。任何形式的Ag暴露都显著减少各种植物类型的生物量（图1）。然而，在所有4种Ag处理组中，gamma;-ECS海甘蓝株系分别比野生型植株有明显更高的生物量。野生型海甘蓝生物量分别比200和250 mg/L Ag NPs处理的转基因株系小28-33%和44-46%。相似地，转基因海甘蓝在Ag 暴露下和野生型相比有更高的生物量；在200和250 mu;M，野生型的生物量相比于gamma;-ECS海甘蓝分别减少39-43%和27-33%。共同地，Ag NP暴露对野生型和转基因型海甘蓝造成了更多的损害，相比于Ag 实验组的结果。纳米尺寸效应可能是主要原因，超过了Ag 的毒性。

在暴露于Ag NP和Ag 后，转基因海甘蓝株系表现出更高的抗性并且明显比野生型健康（图1）。和最近大量的研究一致，Ag NPs比相应的bulk和离子产生更大的生理毒性。

3.2 Ag暴露的海甘蓝的叶绿素含量分析

因为叶绿素是关键的光合色素，叶绿素水平可以作为植物毒性的指示。在对照组植物中，野生型和转基因海甘蓝叶绿素含量没有明显差异（图2）。在Ag暴露后，所有植物的叶绿素含量都减小，与Ag的类型和浓度无关。然而，与上述生物量数据相似，在所有四种Ag暴露条件下，gamma;-ECS海甘蓝株系均显著高于野生型。野生型海甘蓝叶绿素含量比200和250 mg/L Ag NPs处理的转基因株系分别少47minus;49%和34-42%。相似的是，在Ag 暴露下，转基因海甘蓝叶绿素含量明显比野生型高；在200和250mu;M，和gamma;-ECS相比，野生型的量分别减少47-49%和39-40%。

附加实验计划描述Ag-NP-诱导的叶绿素水平减少的机制，这可能是由叶绿体的形成受抑制引起或者直接相互作用导致叶绿素的降解。从Ag-NP-处理的拟南芥的分子应答方面，观察到原叶绿素酸脂还原酶（与叶绿素合成有关）转录水平的下调。这个结果可以进一步引导我们理解在Ag NPs存在时叶绿素降解发生的机制。

3.3 Ag暴露对海甘蓝蒸腾作用的分析

为了理解Ag NPs对植物蒸腾速率的影响，我们设置了水培系统如支撑材料图S3所示。蒸腾速率通过计算超过24 h间隔为期5天每个重复组水体积损失来测定（图3）。和生物量及叶绿素结果相似，Ag NP暴露5天后蒸腾速率减小，与浓度无关，但是gamma;-ECS海甘蓝株系都比野生型蒸发更多溶液。250 mg/L AgNPs处理的野生型海甘蓝是蒸腾速率与转基因株系相比显著减少35-46%（图3B）。植物暴露于200 mg/L AgNPs时得到相似的蒸腾速率结果（数据未显示）。250 mu;M Ag 对溶液蒸腾速率没有影响，与植物类型无关。也没有观察到200 mu;M Ag 对蒸腾速率的影响（数据未显示）。

我们的发现与Stampoulis et al.一致，与bulk和对照组相比，Ag NPs减少瓠瓜蒸腾体积75%。相反，生长在CeO2 NP修饰的土壤中的玉米和萝卜植株的蒸腾速率不受影响。另一个研究证明，TiO2 NPs可以显著提升水培条件下榆树的蒸腾速率。尽管众所周知的Ag NPs的毒性，这个发现十分有意义因为在相等的暴露下，gamma;-ECS海甘蓝株系产生显著更大的生长（生物量和蒸腾作用），极大地暗示了在抵御NP诱导的非生物应激中GSH代谢。

3.4. Ag暴露的海甘蓝脂质过氧化分析

野生型和转基因型海甘蓝膜完整性通过MDA形成来评价（图4）。不管Ag形式，相比于两种转基因株系，野生型海甘蓝芽组织中产生更高的MDA含量。在200 mg/L Ag NPs和200mu;M Ag 处理下，gamma;-ECS海甘蓝的MSA含量比野生型分别减少27.3-32.5%和20.6-33.6%。相似地，在根中，转基因株系中MDA含量明显更低，说明gamma;-ECS工程植物对金属胁迫表现出更高的抗性，与金属形式无关。其他NPs也可以引起植物中产生过量的MDA，表明在基于金属的NPs存在下植物发生氧化应激。曝露下，氧化铜纳米颗粒计量增加，绿豆根中丙二醛含量显著升高。测定CeO2 NP处理的拟南芥MDA含量较高。然而，CeO2纳米粒子不可以诱导脂质过氧化作用的玉米植株或芸豆

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