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生物肽与不锈钢的反应—一种新型有机生物金属的生成

生物肽与不锈钢的反应-一种新型有机生物金属的生成

Elisabeth M. Davis , Dong-yang Li , Randall T. Irvin

摘要：我们观察到从金属结合菌毛中的天然蛋白质衍生出的合成缩氨酸与不锈钢通过一种未知的自发性化学反应产生了另一种不锈钢，我们称之为生物有机不锈钢。生物有机不锈钢具有显著提高的电子逸出功（从4.79plusmn;0.07eV增长到4.9plusmn;0.05eV），具有降低的材料粘合力（56.7plusmn;10.5nN变化到19.4plusmn;8.8nN），并且比常规的304号不锈钢显著地更硬（大约更硬40％）。一个菌毛受体结合域和不锈钢之间产生的一个正式或半正式的有机金属共价键，不锈钢基于XPS分析表明该表面的电子状态已经改变了。进一步说,我们建立该肽钢反应可以演示天然的L-肽、D-肽反应和D-肽逆反应的立体定向度，生物有机钢材产量可以通过EWF的结果来区分（分别为4.867plusmn;0.008eV，4.651plusmn;0.008eV，及4.919plusmn;0.007eV）。我们的结论是生物有机钢肽和钢表面之间的电子共享，将会导致表面电子的稳定化从而生成生物有机钢，该钢与原始反应钢相比，属性有所变化。从逆序反转-D-肽产生的生物有机钢产生一种蛋白酶稳定产物会更硬（在400uN负载下更硬42%），并与常规不锈钢相比具有降低50％的腐蚀速率（分别为0.11plusmn;0.03mpy和0.22plusmn;0.04mpy）。生物有机钢材可以轻易制造。

关键词： 肽,不锈钢,菌毛受体结合域,电子逸出功,XPS,附着力,腐蚀

1. 简介

细菌从人类细胞到不锈钢水槽和浴盆，在许多材料的表面上以惊人的效率地结合和生长着，铜绿假单胞菌（PA）利用受体结合域（RBD）在其IV型菌毛尖端（T4P）显示相结合。 T4P是一旦绑定的表面接口上产生很大的力就通过沿细菌表面收回菌毛的强大的纳米发动机。功率放大器RBD对于不锈钢[1,2]具有令人难以置信的高表观亲和力，不能轻易地理解给出柔性肽与不动的表面相互作用和通过原子力显微镜对RBD钢直接测量相互作用相关的高熵惩罚已确认为一个非常强的分子相互作用[2,3]。

PA是人类条件致病菌，利用其T4P粘附和殖民在各种生物和非生物表面。由RBD介导结合，一个半保守的17氨基酸区域包括一个链内二硫环编码菌毛结构蛋白的C-端区域内，称为PilA，在PA的T4P内。RBD具有对不锈钢极高的亲和性，由大约0.21nM的K例证来抑制纯化的菌毛（被认为在光纤的前端显示3个RBD）和可行的与钢结合的PA细菌（每个单元的数的T4P位于棒状细胞的两极），特别是当相对于前面对金属结合肽[4]报道的毫范围的亲和力，虽然最近一个相当高的亲和力（116纳米）为钛结合肽是[5]通过噬菌体展示获得的。的RBD直接结合钢和该相互作用不出现由疏水相互作用[2]介导的。然而，与上皮细胞中的RBD相互作用是相当低的亲和力（w200,000倍低级）并显示带有的GalNAc-Gal的的最小的受体的相互作用主要通过疏水相互作用介导[6]。

不锈钢在本质上是多晶的，单独的晶体被称为晶粒,而位于相邻的晶体之间的界面区域被称为晶界。晶界是在有显著晶体缺陷和各种类型位错的金属的区域。在这些有缺陷区域的电子处于较高的能量等级，使该区域更多反应并且更加能够与超出金属范畴的其它材料相互作用。晶界材料的表面性质与从晶粒内所观察到的表面特性不同。 PA优先结合晶界[1,10]并且在晶粒边界比打破RBD钢相互作用所需要的力是相当高的（大约是原来的2.2倍） [3]表明了表面电子活性或有示差的材料组成的晶粒与晶界相关的晶粒TiAl基合金材料组成显著贡献的互动。通常，细菌与非生物表面结合被认为涉及了结合到表面的被吸附有机材料的调理膜细胞的相互作用。结合是通过疏水相互作用，由于主体溶剂能量贡献而被排除的相互作用[11,12]的位点。然而，RBD钢的相互作用不需要主体溶剂，并且未涉及调理膜[2,3,13]。不锈钢的表面自由能可以通过调节晶粒的大小[3]而显著改变。纳米结构（钢虽小但有明确的晶粒尺寸）和表面特殊的电子活动或由EWF和粘合力的测量来确定表面自由能，被用来直接证明RBD钢的相互作用强度与表面电子活性成正比[13]。因此即使RBD相同的情况下，介导RBD结合到生物表面的相互作用机制也不同于将其介导结合到不锈钢表面的。

虽然我们关于RBD钢相互作用的观察似乎有一个健全的材料基础，并且反映出了钢表面的材料属性，基于RBD与不锈钢相互作用的分子从生物学的角度来看，正令人费解地作为大多数生物相关的配体受体的由疏水效果热力学驱动相互作用。鉴于RBD对钢的亲和性非常高（超出了柔性肽结合至固体表面的预期，其中可能会遇到熵惩罚），与钢的相互作用并不需要调理膜，该疏水的相互作用并不会助力于该相互作用，并且相互作用的强度正比于表面的电子活性或表面自由能，我们推测该RBD可能会形成与不锈钢表面半正式或正式共价键通过RBD来使表面电子离域，因此调查了RBD钢本质的相互作用。报告得出，PA RBD形成一个先前未报告过的与钢的化学相互作用，可以改变的不锈钢的表面层的表面电子轨道形成了一种新的材料，我们称之为生物有机新材料K122-4不锈钢（borg-K122SS）。

1. 材料和方法

如Wong等人所描述，K122-4（128-144）牛肽通过固相肽合成法合成，并经反相高效液相色谱法（HPLC）纯化[14,15]，通过空气氧化[16]生成用于本研究的肽的二硫桥形式。如先前由Yu等人所述一样进行肽的生物素化[17]。肽是由在菲茨西蒙斯的科罗拉多州健康科学大学研究中心肽和蛋白质化学核心设施上通过基础服务合成的。生物素化的菌毛和肽结合到不锈钢的能力是由Giltner等证实的。[1]

将标号304不锈钢2B精加工板（1毫米厚，20号钢）切成1cmtimes;1cm的试样，并在1040℃下退火1小时。将表面使用增加粒度（MetTech公司，卡尔加里）的砂纸，在120＃到1200＃砂砾和0.05mm的胶体二氧化硅的水性淤浆中进行研磨至均匀。取样片用餐具洗涤剂，用蒸馏水彻底冲洗，并浸泡在95％（V / V）乙醇中进行缓慢搅拌15分钟。取样品，然后用蒸馏水冲洗，用15毫升丙酮洗1分钟，再用蒸馏水冲洗。它们被放置在6个孔（每孔1份样品）组织培养板（Corning）中，并覆盖有3毫升的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）包含有10mg/ K122-4毫升（128-144）牛肽，并在室温（RT）下温和搅拌1小时。样品用蒸馏水洗涤6次，并在空气中干燥。

铝（5mm厚）每1厘米样品切成1厘米。把铝样品进行清洗，打磨，并涂上K122-4（128-148）牛肽。铝被选择作为RBD的控制表面并未与铝进行相互作用，因此在表面上被用作对RBD材料属性沉积的控制。

腐蚀，如所描述的一样在环氧树脂封装试样（LECO公司，米西索加）在抛光钢之前进行退火。一旦抛光，将样品清洗并如所述涂覆。

EWF被定义为是使用扫描Kelvin探针[18]和对每个样品的三个区域（0.5毫米*0.5毫米）进行扫描测定。数据被绘制为每扫描区域电子伏特（eV）的装置。电子功函数（EWF）是用装有1mm直径的Au尖端[18]的扫描开尔文探针（KP技术有限公司，英国）测定的。探针是由由一台计算机控制的三个子系统组成，包括一个数字振荡器，数据采集，和样品的翻译。三轴微定位器控制每步0.4毫米在样品上的尖端的精确位置进行扫描。该Kelvin探针的示波-特征研频率为173赫兹。通过对0.5mm*0.5mm三个分开的区域上各样品进行扫描，以确定所述电子活性，以100为基准进行对总区域扫描结果的读数。

配备有氮化硅尖端的AFM来测量粘合力[3]。每个样品可获得五十粘合力。一个在标准的AFM氮化硅尖端（Veeco公司，CA）和一涂肽-表面之间的粘合力，是用原子力显微镜（AFM）（美国Hysitron，明尼阿波利斯，美国）进行测定的。原子力显微镜是在“接触”的模式下使用的。尖端靠近表面，允许与表面接触，以及当使用激光束测定时，尖端拉从表面，悬臂偏转的总量误差反映了粘合力。相关的力可以被定量，如果弹簧常数是已知的。对于氮化物尖端的弹簧常数为0.06牛顿/米。

用一个装有金刚石压头的超微显微镜进行纳米压痕测量。样品用荷载为50~800微米和总深度位移（单位nm）进行测量。一个超微显微镜（美国Hysitron，Minneapolis，美国），将一、纳米机械探针与AFM相结合，用来研究涂覆肽样品的机械性质的变化。该探针具有金刚石棱锥维氏压头，具有150nm的标称半径100nN的测力灵敏度和0.2纳米的位移分辨率。测量过程中纳米压痕对每个缩进和尖端的总深度位移在样品表面上的力进行测量，并获得深度曲线。每次负载，获得五个压强与深度的相关曲线。

有些样品对它们的腐蚀性能进行了测试。最少使用每样品，用计算机化扫描出的三个线性极化和Tafel曲线来确定每份样品肽涂层的极化电阻和腐蚀速率。利用电脑扫描恒电位仪（型号PC4-750，Gamry）进行电化学测试。饱和甘汞电极（SCE）和铂（Pt）金属箔被用于所有腐蚀试验的计数器电极和参考电极。使用的电解质溶液是自来水，在室温下进行所有的实验。进行至少三个独立的直线偏光腐蚀试验来测量polari-zation的电阻Rp，从低于0.02 V开始开路电势（OCP）和以高于0.02伏结束OCP并采用0.125毫伏/秒的扫描速率。进行三个极化曲线腐蚀试验中最小的那个。用1毫伏/秒的扫描速度并扫描来自开始低于0.25 V和结束高于0.25伏的OCP。使用SterneGeary方程来获得的腐蚀速率和偏振性。

表面电子活性是通过XPS分析研究的。XPS分析可使用AXIS-165光谱仪（奎托斯分析）。在分析室中的基础压力低于3*10 -8帕。单色铝Kа源（HNfrac14;1486.6电子伏特）在210瓦的功率下使用，分析点为400*700微米。该仪器的分辨率对于Ag3d为0.55电子伏特,对Au 4F波峰为0.70电子伏特。调查扫描收集了通过160伏特的分析仪传递能量和一个为0.35电子伏特的步骤，从1100eV到0的结合能量。对于高分辨率光谱传递能量为20电子伏特与0.1和0.15伏特之间的工序。没有电荷被中和。为了增加表面灵敏度将样品倾斜，使得样品表面和分析器之间的角度为30。无需样品在分析前被蚀刻。数据分析通过卡萨XPS软件、版本2.3.13完成。

我们用标准SEM和AUGER分析方法测定表面形态的样品。通过一个场发射的微探针JAMP-9500F（JEOL）收集SEM和AUGER数据。初始的电子束能量为10千伏，并且在探测束电流为7nA。SEM和AES的横向分辨率分别是3.0和8nm，将样品偏离电子仪的轴向主光束倾斜30度。 SEM图像被用来收集Auger能谱的定位，剖面线，和图像的位置。自动探测跟踪的成像期间由于电源、温度等的不稳定性可有效消除漂移，图像中和线轮廓分布的强度通过（P-B）/B的计算，除去边缘效应，P是波峰强度，B是背景的强度。这些图像热规模中呈现，对应于最高强度的明亮部分。

A）borg-K122SS的电子功函数和304钢用Kelvin探针进行测量。三个区域（1毫米*1毫米）进行扫描。共有100个测量被用于每单位区域和绘制手段。 B）铝是否接触到K122-4（128-144）牛肽的电子功函数测量。

C）在borg-K122SS和304不锈钢上用搭载了非导电氮化硅悬臂的原子力显微镜（AFM）进行粘合力的测量。每个样品采取五十种力测量。 D）铝是否接触到K122-4（128-144）牛肽的粘附力测量。

E）borg-K122SS和304钢的纳米压痕测量。每个负载采用五个位置测量。F）铝是否接触到K122-4（128-144）牛肽的纳米压痕测量。图1. 表面电子反应性的变化，粘附力和borg-K122SS钢的硬度与304不锈钢和有无K122-4（128-144）牛肽的铝相比。

A）01 S的轨道

B）与borg-K122SS表面相关的有一个身份不明的波峰的硫1S轨道区域，

C）与borg-K122SS表面相关的有一个身份不明的波峰的铁3S轨道区域。borg-K122SS的XPS谱用绿色绘制，而304不锈钢的XPS谱则用红色绘制。（对于这个图例颜色的引用解释，读者可以参考这篇文章的网页版。）图2. borg-K122SS和304不锈钢的元素组成的X射线光电子能谱分析。borg-K122SS和304钢XPS谱。

作为受体结合域包含的潜在胰蛋白酶切割位点，我们通过修改钢表面的能力研究了胰蛋白酶。304不锈钢2B精加工板（20号，1毫米厚）如先前所述进行清洗[1]并组装进入的Schleicher和Schuell Minifold系统（Mandel Scientific）中。合成生物素化的PAK（128-144）牛肽分别以10毫克/毫升的浓度（每孔50毫升重复5次）向不锈钢管加入，并在室温下培育并温和搅拌1小时。所述总管在250毫升的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中洗涤六次。为了测试肽是否对胰蛋白酶敏感，加入1毫克胰蛋白酶溶液（每孔100毫升，共5孔），并将总管在37℃温和搅动下培育1小时。总管用PBS洗涤6次，剩余的结合肽使用链霉抗辣根过氧化物酶（HRP，Sigma公司）在PBS中进行1：5000的稀释。接着在RT培育1小时，总管用PBS洗涤和在底物缓冲液加入（0.01M的柠檬酸钠，含有1M 2,20连氮基-双-（3-乙基噻唑啉-6-磺酸），二铵盐pH值为4.2 （ABTS）（S

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