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面包酵母催化（4S）-（ ）-香芹酮的不对称还原反应，是一种监控转化的绿色方法，以具有聚丙烯中空纤维膜的三相液相微萃取系统为基础。

作者：Vanessa Dutra Silva^a , Jeferson Schneider Carletto^a , Eduardo Carasek^a ,Boris Ugarte Stambuk ^b , Maria da Graca Nascimento ^alowast;

巴西，弗洛里亚波诺波利斯88040-900，卡塔琳娜联邦大学，化学系

巴西，弗洛里亚波诺波利斯88040-900，卡塔琳娜联邦大学，生物化学系

文章信息

文章历史：

2013年1月4日收稿

2013年5月6日收修改稿

2013年5月11日收录

2013年5月22日网上可获得

摘要

alpha;，beta;不饱和羰基化合物（4S）-（ ）-香芹酮，可使用面包酵母选择性还原成（1R，2R，4S）-二氢香芹醇。通过绿色中空纤维三相液相微萃取技术监视生物还原反应的转化。一些能会影响（4S）-（ ）-香芹酮的生物还原的参数，比如温度、时间、底物或酶的比例、pH以及缓冲液的浓度，都会被评估。在含0.1mol/l浓度的缓冲液（pH7.5）、底物和酵母细胞的质量比为8.0mg/g的单水相系统中，44摄氏度下，经过48小时后，（1R,2R，4S）-二氢香芹酮回收转化率达52.7%，非对映结构大于99%。中空纤维三相液相微萃取技术，涉及有机溶剂的使用，允许99.5%以上的还原反应的优化。

关键词：（4S）-（ ）-香芹酮、酿酒酵母、中空纤维、三相液相微萃取、生物还原

介绍

由酶和微生物催化的生物催化反应，主要因其高选择性（化学选择性、基团选择性、立体选择性）、温和的反应条件（常压和室温）、相当小的涉及到保护与解保护步骤，广泛应用于有机物的合成。而且，对环境影响及副产物产生的减少，使得生物催化的反应的使用成为一种有力的工具，在生物技术及绿色化学中愈为重要。全细胞，而不是分离的酶，在生物催化中优先使用，不仅仅避免了酶的纯化，而且由于细胞含有所有的辅助因子及其代谢再生途径，全细胞就不需要辅助因子的额外加入。酿酒酵母是酮、beta;-酮酯、亚胺、由强极性群，如N、C、H激活的带有C=C的alpha;、beta;激活的不饱和系统。这些酵母细胞易获得、实惠、作为氧化还原反应生物催化剂具有高度立体还原选择性。单萜如（4R）-（-）-香芹酮和（4S）-（ ）-香芹酮,它们是alpha;，beta;不饱和羰基化合物，曾使用许多种细胞类型，包括细菌、真菌、酵母、植物细胞、海洋微藻，进行生物转化。文献中所报道的可用数据说明，这些化合物的生物还原，很多情况下产生不饱和的酮、二氢香芹酮、饱和醇、二氢香芹醇的混合物，很少会产生丙烯醇、香芹醇，这表明几种酶可能会相应地催化C=C及C=O的还原。

由于天然环境条件有利于酵母细胞的催化活性，水溶液成为生物催化反应的传统培养液。然而，监控化学反应会产生重要的残渣，每一个需要分析的反应会广泛用到许多毫升的有机物，就使得经典的液液萃取方法对于分析学家来说，费力、慢、耗费时间。况且，为避免在随后分析过程中出现的干扰，需要高纯度的试剂，这就增加了运作的成本。为减小这些问题，以三相液相微萃取为基础的微萃取技术，具有渗透的中空纤维聚丙烯膜，此膜用于萃取剂的惰性支持物。这种方法的主要优点在于，减少了萃取反应中所用到的有机物的体积-每厘米的膜片不超过10ul。而且由于低萃取容量，反应液中膜的存在并没有影响到它的平衡，使得多萃取能够直接在主要容器中进行，并不需要产生反应。而且，少数残渣的产生，由于低水平的操作和自动化的可能，就会有更少的污染风险的产生，都是微萃取方法积极的一面。

本次研究，利用面包酵母在单相液相系统中还原（4S）-( )-香芹酮，为获得转化优化及非对映选择值，评估了一些实验条件。一种绿色环保的转化方法也被报道，它依赖于带中空纤维聚丙烯膜。

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1酵母

六株S.cerevisiae酵母菌株使用的是有活性的干酵母，四株商业干酵母类型为Fleischmann,Dona Brazil,Nordeste和Brugguemann,两株工业酵母菌株（CAT-1和PE-2），这两株菌株在巴西被广泛地用于酒精生产。自从二十世纪90年代后，这两株菌株就得到了商业化的使用。脱水的酵母团细胞被直接用于减少反应，这个将会在下文进一步描述。

2.1.2化学试剂

试剂包括：（4S）-（ ）-香芹酮（98%），（ ）-二氢香芹酮[n-,~75%.iso-,~6%,neo-,~3%,neoiso-,~13%]，和海藻糖购自Sigma-Aldrich公司；磷酸钾溶液以及硼酸购自Vetec公司；n-己烷和甲苯购自F. Maia公司；柠檬酸购自Acros公司；氢氧化钠和DMSO购自Grupo Qumica公司；盐酸购自Carlo Erba公司；金属锌购自Riedel-De Haen AG公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸购自Fluka公司；氘代盐酸来自Cambridge Isotope Laboratories。

2.2分析

核磁共振氢谱按照国际标准使用TMS在Varian Ac400F分光仪上进行。气相色谱试验使用的是Agilent 78202A GC仪器，装备有手性柱子beta Dex 110 30mtimes;0.25mmtimes;0.25mu;m 薄层厚度。注射温度和检测温度为230摄氏度，柱子的温度设定在90-135摄氏度（10摄氏度每分钟），135-140摄氏度（2摄氏度每分钟）和140-220摄氏度（10摄氏度每分钟）。气相色谱法分光仪搭载在Shimadzu GC-MS QP2010上，配备有溶源硅毛细柱子Rtx-5MS 30mtimes;0.25mmtimes;0.25mu;m。烘烤温度程序和注射温度程序和前面描述是一样的除了注射和检测温度，前面的在280摄氏度而后面的在260摄氏度。离子源温度设定在200摄氏度，转换线温度设定在250摄氏度，混合获取物在40-400m/z。峰值使用NIST Mass Spectral Search Program 识别。

2.3单相液相中酵母催化活性还原的大致过程

在包含30毫升所需pH柠檬酸、磷酸、硼酸缓冲液的125ml的锥形瓶中，加入0.5mmol（4S）-（ ）-carvone和和3g BY。反应混合物在20-50摄氏度之间磁性搅拌箱中孵育。反应时间都取整数，按照下述方法萃取，手性气相色谱用于产物的转化率及非对映结构的比例。底物和产物最终的峰值会来比较，所有区域的总和被认为为100%。在手性气相色谱实验中，产物的保留时间如下：(1S,4S)-反式-二氢香芹酮(8.8), (1R,4S)-顺式-二氢香芹酮(9.0), (1R,2R,4S)-iso-二氢香芹酮(9.9).产物的最终识别是通过气相色谱法，气相-质谱联用仪，核磁共振氢谱等分析方法来实现的。

2.4水/有机两相中酵母催化活性还原的一般过程

BY（3g）加于已经盛有30毫升柠檬酸、磷酸、硼酸缓冲液的125毫升锥形瓶中，调节到预定的pH加入30ml己烷30毫升（4S）-（ ）-香芹酮。反应混合物在26摄氏度摇床或磁力搅拌箱孵育。反应时间都取整数，反应都是整点的，使用具中空纤维薄膜的三相液相微萃取技术萃取产物，使用手性气相色谱分析产物。

2.5微萃取过程

管状渗透聚丙烯膜被切割成1.0厘米长度的片段，直径相同的不锈钢金属丝被插入硅隔膜聚丙烯反应物中。在使用前，HF组分膜铺平整个不锈钢金属丝。线的螺旋盖子和膜管放置在包含反应介质的瓶。整个系统是保存在一个恒温槽磁搅拌器,从而在搅拌过程中能够控制温度和搅拌速率。提取后,中空纤维膜被从样本和不锈钢丝中移除,并转入一个埃普多夫包含一个非常小的体积(0.075毫升)，以便使用超声波浴进行后续的萃取步骤。最终溶剂由手性气相色谱直接分析。这个过程的更多细节可以在我们之前的工作中找到。

3.结果与讨论

在单水相系统中，由商业化酵母介导的生物还原（4S）-( )-香芹酮所获得的主要产物是（1R，2R，4S）-二氢香芹醇，碳碳双键及碳氧双键均被还原，且非对映异构类型超过99%，然而，（1S，4S）-反式二氢香芹酮及（1S，4R）是作为次级产物获得。来源于生物转化的化合物是由核磁共振氢谱及气相-质谱联用仪来表征。并与制备好的标准化合物（二氢香芹酮）作比较，使用手性气相色谱来分析商业化的（ ）-二氢香芹醇。

（4S）-（ ）-二氢香芹酮生物还原的有关产物，我们现在所陈述的结果与先前Goretti所报道的不一样。由6个属14个种的16个酵母菌株介导的相同底物的不对称还原反应，总而言之，不依赖于细胞的物理状态（生长、休眠、冻干），主要的产物还是（1S，4S）二氢香芹酮，然后就是（1R，4S）-二氢香芹酮、（1R，2S，4S）-二氢香芹醇，（1S，2S，4S）-二氢香芹醇，（1S，2R，4S）-二氢香芹醇。

3.1中空纤维状聚丙烯膜的微萃取

面包酵母作为生物催化剂来获得（1R，2R，4S）-二氢香芹醇，为了方便研究，使用具渗透性中空纤维状聚丙烯薄膜三相液相微萃取系统来检测，微萃取过程的不同阶段在2.5节描述。

第一步,为了验证所提出的方法可以用于监控(4S)-( )-香芹酮的生物转化,校准曲线使用不同比率的标准二氢香芹醇,二氢香芹酮和(4S)-( )-香芹酮来构造,来证实用这种技术所获得产品和试剂的比例是否与已知的比例相同。

标准曲线方程是Y=0.49 1.02X, R=0.9989。线性相关性被发现以来,该方法监测期间形成的化合物的反应确实代表了培养液中实际的浓度比。进一步的实验使用了经典的液液和具中空纤维状薄膜的三相液相微萃取，在还原（4S）-（ ）-香芹酮反应中，在含缓冲液单相中和缓冲液及己烷双相系统中都添加了面包酵母，来验证这些结果。应用这两种方法, (4 S)-( )-香芹酮,二氢香芹酮，二氢香芹酮萃取后恢复相似。经典液液萃取所使用的有机萃取溶剂及反应中产物体积之和为20ml，在HF-LLME只有0.075毫升是必要的。这个结果代表超过99.5%的还原与有机溶剂的使用是相关的,成为微萃取方法的一个优势。

合适的溶剂的选择是十分重要的，并且，溶剂通常是和反应液有着密切的关系的。在这项研究中，二氯甲烷或三氯甲烷的使用并不是随意的，因为这些组分有较强的亲水性，此外，一些很重要的支持溶剂在培养过程中会消失。辛烷，一种溶剂，表现出极其好的适应性，比如低的水溶性，高的萃取率等。但是在目前这种情况下，溶剂的保留时间和产物的保留时间过于接近，而无法使用。在本文中，甲苯成功的使用了。萃取时间的研究是确定的，5到20分钟，很明显，反应时间处于10到15分钟之间对于反应的效率的最为合适的。因此，15分钟被用于进一步的试验。HF-LLME这种方法也成功的在两相中使用。在这种情况下，渗透膜不在需要提前浸润溶剂，因为化学反应的有机相在接下来的过程中将会出现。这一操作避免了乳化现象的出现，因为在有酵母的条件下，两相混合。

因此，这一方法将会应用于下面所有的研究。而且，为了提高转化效率，非对映异构（1R,2R,4S）-iso-二氢香芹酮，一些实验组分会选用最佳的。

3.2 反应体系的对比

面包酵母在单相与双相系统催化还原（4S）-（ ）-香芹酮的反应被作比较。单相：含柠檬酸盐或磷酸盐或硼酸盐。双相：水相/有机相，由相同的缓冲液及己烷形成。26摄氏度下反应24h。比较结果见表格1N-己烷被当做有机溶剂使用，有机相的体积组分与水相的体积组分比为Vaq/Vorg，%。

正如此表所示，相比于双相系统，当使用单一相反应体系时，产物的转化率会很大的提高。当使用两相体系时，转化率大幅度下降的原因可能是由于两相体系中存在有机相，有机相会破坏细胞膜，从而使酵母活性下降。但是，当在搅拌的情况下，轨道搅拌或磁力搅拌都能够使单相反应体系和两相反应体系的转化效率一致，且（1R，2R，4S）二氢香芹醇都是主要的产物（d.e＞99%），因此，在下一步的实验中，单相反应体系将会使用轨道搅拌。

3.3酵母筛选

在本实验中，四种商业酵母和两种工业酵母将对其还原（4S）-（ ）-香芹酮，产生（1R,2R,4S）-二氢香芹酮的能力进行评估。所有的工业和商业酵母，除了工业酵母PE-2菌株仅能获得低转化率，转化率为1.1%，经都能够测试用来还原（4S）-（

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