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分子催化学报B

在水单相和双相体系中，面包酵母催化（4R）-（-）-香芹酮的不对称还原

Vanessa Dutra Silva^a, Boris Ugarte Stambuk^b, Maria da Graca Nascimento^a.

a化工部门，圣卡塔琳娜州联邦大学，弗洛里亚诺波利斯88040-900，巴西

B生化部门，圣卡塔琳娜州联邦大学，弗洛里亚诺波利斯88040-900，巴西

文章信息：

文章背景：

2011年10月20日收到 关键词：

2012年1月12日修订 （4R）-（-）香芹酮

2012年1月12日接收 酿酒酵母

2012年1月21日发布网上 生物转化

摘要：

（1R,4R）-二氢香芹酮（2），一种重要的可再生基础材料，在水单相和双相体系中由面包酵母介导，通过还原（4R）-（-）-香芹酮（1）的不饱和碳碳双键可制备得到转化率良好和极好d.e.值的2。一些参量可以改变这个生物还原反应，如酵母浓度和底物浓度，温度，PH值，都可以被检测调查。在1生物转化的过程中加入不同添加剂的效果也可以被探讨。结果表示，转化率和d.e.值也主要取决于这些变量。最佳反应条件是100g/L的酵母，16.6mM底物，PH7.5，26℃，加入DMSO，海藻糖或蔗糖作为添加剂。在最佳条件下，获得的（1R,4R）-二氢香芹酮的d.e.值为92-99％，转化率为70-74％。

1. 简介

使用生物催化剂的化学转化是精细化学品和光学活性化合物的标准合成的有效，有时是更可取的替换方法【1-4】。使用生物催化剂是有利的替换方案，主要是因为它们的高选择性（化学选择性，区域选择性和对映体选择性），且在温和条件下符合环保标准【5-7】。拆分酶和全细胞可以作为不对称合成中的生物催化剂。使用拆分酶常常可以避免不同对映体选择性的竞争催化问题，从而得到更高的e.e.值。问题是，减少的辅酶，必须在二次催化循环过程中原位再生或是在化学计量级依数供给以维持催化活性。因此更多人选用全细胞，因为它们有自己的辅酶再生系统而并不需要添加外源性辅酶【3，7-9】。酿酒酵母（面包酵母）或许是科学界及生产界众所周知的全细胞生物催化剂了。面包酵母经常被有机化学家用来介导由强偏振基团（如硝基，羰基或羟基）引起的含有C=C的alpha;，beta;-不饱和系统，酮，酮脂和亚胺的不对称还原【10-16】。

研究者们一直对香芹酮、薄荷醇、香茅醇和香叶醇等广泛适用的单萜类感兴趣，因为它们的微生物和酶的生物转化将得到更具价值的衍生物，这些衍生物在香水、食品和制药产业都具有潜在的经济价值【17,18】。香芹酮（5-异丙烯基-2-甲基-2-环乙烯酮），一种单环单萜酮，有70多种不同植物可以制备它。它有两种基本异构体形式：（4R）-（-）-香芹酮，薄荷精油的主要成分（绿薄荷）；以及（4S）-（ ）-香芹酮，香芹籽（葛缕子）精油和莳萝（莳萝子）精油的主要成分。两个对映体都可以在自然产物的不对称合成中使用【19】。之前已经使用过包括细菌、真菌、酵母、植物细胞培养和海洋微藻等不同类型细胞催化（4R）-（-）-香芹酮和（1R,4R）-二氢香芹酮的不对称还原【17-21】。文献中的适用数据表明，许多情况下，这些化合物的微生物还原得到饱和酮、饱和醇和少量的烯丙基醇的混合物。这表明存在几种可以催化C=C和C=O还原的酶，且它们之间存在竞争【17-19,21】。 例如，Shimoda和Hirata【22】研究了长变胞藻的培养细胞催化（4S）-（ ）-香芹酮和（4R）-（-）-香芹酮的还原。在后一种情况下，细胞还原C=C邻近的羰基且得到（1R，4R）-二氢香芹酮和（1R,2S,4R）-二氢香芹醇（4）的转化率分别为0—60％和0—38%。而在（4S）-（ ）-香芹酮的研究中，（1R,4S）-二氢香芹酮和（1R,2S,4S）-二氢香芹醇的转化率分别为0—62%和0—25%。另一方面，当我们从长变胞藻细胞中分离出两种alpha;，beta;-不饱和羰基化合物催化剂（催化剂I和催化剂II），催化（4R）-(-)-香芹酮和（4S）-（ ）-香芹酮的还原，我们得到了（1R,4R）-二氢香芹酮和（1R,4S）-香芹酮（3）的单一产物。

在纯酶或微生物介导的反应中可以添加几种添加剂以提高活性并增加转化率和选择性。一些醇类或糖（例如葡萄糖）可以在辅酶再生循环的代谢过程中作为电子供体【23,24】，而二糖海藻糖却可以保护细胞膜和其它结构【25,26】。离子液体和共溶剂可以通过增加难溶性底物和产物的溶解来提高活性【27,28】。

在本研究中，工业可用面包酵母（BY）用作水单相或水/有机双相体系中（4R）-（-）-香芹酮还原的催化剂，得纯对映体（1R,4R）-二氢香芹酮。这种化合物可以用作一些生物相关分子合成的前体，如（-）-罗汉柏烯【29】，10a-乙酰氧基-1aH,7aH愈创木酚磺酸钾-4,11-二烯-3-酮【30】和（ ）-杜英【31】。1的操作条件，如面包酵母（BY）浓度，底物浓度，温度和PH值,不同添加剂的添加，可以通过控制变量法优化，以提高2的转化率和e.e.值。

2材料和方法

2.1酵母

干面包酵母（BY）从弗莱希曼有限公司购买并储藏在2-8℃的冰箱中。

2.2试剂

以下试剂直接使用。（4R）-（-）-香芹酮（98%）和（-）-二氢香芹醇（n-，̴ 75%，iso-，̴ 6%，neo，̴ 3%，neoiso-，̴ 13%)(购自Sigma-Aldrich公司）；磷酸钾缓冲液（Vetec）；柠檬酸（Acros）；NaOH（Grupo Quimica）；金属锌（Riedel-De Haen AG)；氘氯仿（99.8%）（英国剑桥大学同位素实验室）。

（Fluka）离子液体，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIM][PF6](≧96%)

1-丁基-3-甲基咪唑鎓四氟硼酸盐[BMIM][BF4](≧97%）

1-丁基-3-甲基吡啶鎓四氟硼酸盐[BMPY][BF4](≧96%)

所有有机溶剂都来自工业途径且都是分析纯级。

2.3二氢香芹酮的制备

二氢香芹酮通过文中描述的金属锌和乙醇氢氧化钾还原（4R）-(-）-香芹酮制备得到【32】,在手性GC和GC-MS分析中作为标准化合物使用。

二氢香芹酮是（1S,4R)-3和（1R,4R)-2非对映异构体按1:4.6混合的混合物，在硅胶色谱柱上纯化后有30%的产量，用正己烷和乙酸乙酯（9:1，V/V)作为洗脱剂。

GC-MS t_R：（1R,4R)-异构体8.2min，（1S,4R)-异构体8.4min。

m/z（相对强度）：152[M] (26),123(6),109(46),95(80),67(100),41(49)。

手性-CG t_R：非对映异构体（1S,4R)-6.4min和非对映异构体（1R,4R)-6.5min。

¹HNMR(400MHz，CDCl₃） （ppm）：1.03（d，3H，J=6.4Hz，CH₃),1.10(d,3H,J=6.4Hz,CH₃),

1.73(s,3H，=CCH₃),1.74(s,3H，=CCH₃),1.3-2.5(m,16H)4.69-4.83(m,4H,C=CH₂)。

2.4（4R)-（-）-香芹酮的生物转化一般步骤

把（4R）-（-）-香芹酮（0.08ml，0.5mmol）和BY（3.0g）加入到一个装有30ml磷酸钾/柠檬酸缓冲液的125ml锥形烧瓶中，调至合适pH值。反应混合物在22-40℃间以恒定转速搅拌反应。间隔特定时间从反应混合物中等分试样，用二氯甲烷萃取（2times;10ml）。对粗产物进行手性GC分析并测定其转化率和e.e.值。这些产物在手性-GC分析中的保留时间如下：（1S,4R）-二氢香芹酮（6.4），（1R,4R)-二氢香芹酮（6.5），（1R,2S,4R)-二氢香芹醇（7.9），（1R,2R,4R)-二氢香芹醇（8.8）和（1S,2R,4R)-二氢香芹醇（9.1）。最终产物通过与之前描述并制备的标准化合物和工业纯样品的手性-GC，GC-MS和¹HNMR谱对照进行辨认。

产物的转化率是通过比较底物和产物的峰面积来计算的。这两个峰面积的总和我们认为是100%，因此（1R,4R）-二氢香芹酮的%d.e.是以下公式计算（1）

影响BY介导的生物还原反应的主要参量在文章中都很好的说明了【14,24】，因此本研究都是使用单一变量法进行研究。

2.5分析方法

（4R）-（-）-香芹酮还原反应通过使用正己烷的薄层色谱（TLC）监测：乙酸乙酯（9:1,V/V)作为洗脱剂，气相色谱仪（GC-14B岛津制作所）配备有手性柱（RT-BetaDEX-SM30mtimes;0.32mmtimes;0.25m，Restek），75KPa的H₂作为气体载体。注入器和检测器的温度都是230℃。A柱设置温度梯度90-109℃（10℃/min），109-116℃（1℃/min）和116-220℃（10℃/min）。底物和产物通过配备有石英毛细管柱Rtx-5MS（5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷，30mtimes;0.25mmtimes;0.2um，Restek）的气相色谱-质谱（GC-MS)(岛津制作所GC-MS 2010 plus）进行表征检测，其中氦被用作气体载体，流速为1ml/min。炉温程序和喷射温度与上面GC描述的一样，除了注入器和检测器的温度是280℃。四级质谱检测器在260℃，70eV电子冲击状态下工作。离子源温度设定在200℃，传输线设置在250℃。主要质谱接收范围是40-400m/z。峰是通过NIST质谱检索程序05（NIST,华盛顿哥伦比亚特区）检测它们的裂解模式来辨认的。底物和产物也可以通过质子核磁共振（¹HNMR)(瓦里安徒400F-400MHz）进行表征检测。

1. 结果与讨论

在水相中对工业纯面包酵母（BY）催化不饱和酮（4R）-（-）-香芹酮的生物转化进行了研究。BY还原1的内环双键得到主产物（1R,4R)-二氢香芹酮（2）和次产物（1S,4R)-二氢香芹酮（3）。优先形成这些产物说明（4R)-(-)-香芹酮的还原发生对映体特异性导致产物有C-1-R和C-6-R的结构。观察结果表明氢通过抗加成在C-1 si面和C-6 re面攻击共轭C=C，形成对映体特异性。参与C-1和C-6上的还原的氢原子分别来源于介质和NADH的前-4R基团上的氢。可以观察到BY介导的1的生物转化生成（1R,2S,4R)-二氢香芹醇（4），然而只是偶尔观察到（1R,2R,4R)-二氢香芹醇（5）和（1S,2R,4R)-二氢香芹醇（6）的痕迹。没有观察到来自甲基乙烯基基团的还原的产物。Carballeira【33】和Hirata【34】等人都报道了类似的R-（-）-香芹酮的还原转化，分别使用在生长条件下的Gongronella butleiri和在水介质中的烟草培养细胞。

对1的还原产物进行¹HNMR，手性-GC和GC-MS表征后，为了提高（1R,4R）-二氢香芹酮的d.e.值和转化率，对其他反应参量进行了优化，例如酵母和底物浓度，温度，pH和添加剂。虽然多元优化方法对于减少实验数量和确定两组或多组变量之间的可能相关性是有效的，但影响BY介导的生物还原反应的大部分参量都已在文献中得到很好的报道，我们决定用单一变量法。

3.1反应介质的影响

首先，分别研究了35℃，pH5.5条件下，（4R）-（-）-香芹酮在水/有机双相体系中和水单相系统中还原成相应的二氢香芹酮，图1显示了反应48h后得到的二氢香芹酮2和3的转化率和（1R,4R)-二氢香芹酮的d.e.值。如图1，在水单相中反应48h后，1还原得到的二氢香芹酮2和3的转化率比在水/有机双相体系中得到的转化率高，（分别为59%和2

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