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从大肠杆菌的葡萄糖中提取肉桂醇葡萄糖苷

Wei Zhou, Huiping Bi, Yibin Zhuang, Qinglin He, Hua Yin, Tao Liu, and Yanhe Ma

Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China.

Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China.

University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.

摘要：松香，是一种肉桂醇葡萄糖苷，是红景天玫瑰中重要的成分之一，它是一种用于数百年的珍贵药草。松香具有多种生物活性。用于生产松香及其衍生物的传统方法是直接从玫瑰花提取，其具有自然资源的有限性和复杂的纯化程序。这项工作在大肠杆菌中实现了松香的从头生物合成。首先，构建用苯丙氨酸合成糖苷配基苯丙烯醇的生物合成途径。随后，将来自红景天（UGT73B6）或拟南芥（UGT73C5）的UGT基因导入上述重组大肠杆菌菌株中以产生松香。然后通过遗传操作优化大肠杆菌的苯丙氨酸代谢途径，工程化大肠杆菌的松香生产达到258.5plusmn;8.8mg / L。本研究为使用葡萄糖作为可再生碳源的松香及其衍生物的微生物生产奠定了基础。

关键词：肉桂醇，松香，红景天，大肠杆菌，生物合成，UGT73B6，UGT73C5

前言

许多苯丙素衍生物具有重要的生物活性。 例如，红景天提取物（松香，肉桂醇甙）也称为肉桂糖苷，是“金根”红景天的主要成分之一，被发现具有抗氧化，神经刺激和保护心脏保护作用。 结构上，松香是肉桂醇的葡萄糖苷，其进一步被糖改性以形成松香或肉桂醇甙。

松香及其衍生物的生产主要取决于从自然资源和田间种植中直接提取玫瑰。然而，自然资源有限，由于其生长缓慢和采取过度，野玫瑰在许多国家被列为濒危物种。田间种植栽培需要至少5-7年才能积聚这些化合物。植物提取不能满足人类社会日益增长的需求。因此，许多研究都致力于使用有机合成和生物技术方法生产松香。使用Mizoroki-Heck型反应完成松香的总合成，产率仅为11％。松香及其衍生物也通过生物转化通过将前体肉桂醇加入到玫瑰花的愈伤组织或毛根培养物中而产生。植物生物技术提供获得天然产物的机会，但难以适应工业规模生产。

微生物细胞工厂的建设是生产高附加值天然产品的有前途的战略。许多植物来源的天然产物已经在微生物中生产。大肠杆菌是代谢工程中最“用户友好”的宿主之一，因为它的代谢和调节被很好地表征，并且广泛使用了各种遗传工具。

松香及其衍生物的生物合成途径已经提出。肉桂醇的生物合成从苯丙氨酸脱氨开始。苯丙氨酸通过苯丙氨酸氨裂解酶（PAL），羟基肉桂酸酯：CoA连接酶（4CL），肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）和醇脱氢酶（ADH）的顺序作用转化成肉桂酸，肉桂酰辅酶A，肉桂醛和肉桂醇。通过肉桂醇的葡糖基化合成松香，最后通过向松香中加入阿拉伯吡喃糖或阿拉伯呋喃糖单元来形成罗素和松香衍生物。已经在微生物中鉴定了各种物种的PAL，4CL和CCR，用于天然产物的生物合成，如（2S）-pinocembrin，香豆素，肉桂醛和单粘蛋白。负责肉桂醇糖基化的酶尚未被记述。

在这项研究中，我们旨在设计大肠杆菌以生产松香（图1）。首先，我们构建了由AtPAL，Pc4CL，AtCCR和内源性醇脱氢酶或醛醇还原酶催化的苯丙氨酸的肉桂醇的生物合成途径。此外，利用红景天（UGT73B6）和拟南芥（UGT73C5）的候选UGT基因用于肉桂醇的葡萄糖基化，我们成功地从大肠杆菌中从葡萄糖中实现了松香的从头生物合成。然后通过遗传操作优化大肠杆菌的苯丙氨酸代谢途径，工程化大肠杆菌产生的松香达到258.2plusmn;8.8 mg / L。我们的研究为使用葡萄糖作为微生物工厂可再生碳源的松香及其衍生物生产奠定了重要基础。

Figure 1. 从葡萄糖到松香的生物合成途径

材料和方法

质粒，菌株和媒介。本研究中使用的所有菌株和质粒均列于表1中。大肠杆菌XL1-blue用于基因克隆和质粒繁殖，大肠杆菌BL21（DE3）及其衍生物用于蛋白质表达和产生的目标化合物。本研究中使用的突变菌株是通过使用lambda;-Red重组从野生型菌株BL21（DE3）产生的。

Luria-Bertani（LB）培养基用于大肠杆菌细胞的培养，用于基因克隆，质粒繁殖和接种物制备。 使用含有1times;M9最小盐，20g / L的葡萄糖，2mM MgSO 4和0.1mM CaCl 2的改良M9培养基作为发酵培养基。根据需要将卡那霉素（50mg / L）和链霉素（100mg / L）加入到培养基中。

质粒构建。本研究中使用的所有寡核苷酸引物列于表2. AtCCR（GenBank：NM_101463.4）和AtPAL（GenBank：AY133595.1）均获自拟南芥的mRNA，该RNA通过RNAprep纯植物试剂盒从天安生物科技有限公司（北京，中国）。来自东洋纺株式会社（日本大阪）的第一链cDNA合成试剂盒用于逆转录。来自红景天的Petroelinum crispum的Pc4CL（GenBank：X13325.1），UGT72B14（GenBank：EU567325.1），UGT74R1（GenBank：EF508689.1）和UGT73B6（GenBank：AY547304）和UGT73C5（GenBank：NM_129235.4）拟南芥由上海生物科技有限公司（中国上海市）合成，密码子用于在大肠杆菌中表达。通过Thermo Fisher Scientific Inc.的高保真DNA聚合酶扩增所有基因。使用一对引物AtCCR-F / AtCCR-R通过PCR扩增AtCCR，并通过NdeI / KpnI位点克隆到pCDFDuet-1中以产生质粒pCDFDuet -AtCCR。用引物Pc4CL-F / Pc4CL-R对Pc4CL片段进行PCR扩增，并克隆到质粒pCDFDuet-AtCCR的NcoI / BamHI位点，形成质粒pCDFDuet-AtCCR-Pc4CL。将AtPAL片段用引物AtPAL-F / AtPAL-R进行PCR扩增，消化，并通过NcoI / EcoRI克隆到pET28a中，得到中间表达质粒pET28a-AtPAL。将具有T7启动子和N末端His标签的T7-atPAL片段用引物对T7AtPAL-F / T7AtPAL-R从pET28a-AtPAL进行PCR扩增，消化，并通过EcoRI / NotI连接到pCDFDuet-AtCCR-Pc4CL中产生最终的重组质粒pCDFDuet-AtCCR-Pc4CL-AtPAL。通过使用引物对UGT72B14-F / UGT72B14-R，UGT74R1-F / UGT74R1R，UGT73B6-F / UGT73B6-R和UGT73C5-F / UGT73C5R将UGT72B14，UGT74R1，UG73B6和UGT73C5进行PCR扩增，并通过NcoI / XhoI分别产生质粒pET28aUGT72B14，pET28a-UGT74R1，pET28a-UGT73B6和pET28aUGT73C5。通过删除反向引物中的终止密码子TAA，将C端His标签与UDP葡糖基转移酶（UGT）蛋白融合。

培养实验。进行培养实验以检查内源性醇脱氢酶和醛糖还原酶在大肠杆菌中将肉桂醛转化为肉桂醇的活性。将大肠杆菌BL21（DE3）的单个克隆接种到5mL LB液体培养基中，并在37℃下以200rpm摇动培养过夜。然后将1mL种子培养物稀释至50mL LB液体培养基中，并在30℃下以200rpm摇动培养。当600nm（OD600）的光密度达到3.0时，通过3220g离心10分钟收集细胞，转移到50mL的M9培养基中。随后，将3mM肉桂醛加入到培养物中，将其进一步孵育3小时。以规律的时间间隔取上清液进行HPLC分析。

肉桂醇的微生物生产。将具有质粒pCDFDuetAtCCR-Pc4CL-AtPAL的重组大肠杆菌菌株BWT01的单个克隆接种到3mL LB液体培养基中，并在37℃下以200rpm摇动培养过夜。然后将1mL预筛选转移到50mL LB液体培养基中，并在37℃下以200rpm摇动培养。当OD600达到0.6-0.8时，加入异丙基-beta;-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.1mM，以在16℃诱导基因表达12-16小时。通过在4℃下以3220g离心10分钟收集细胞，然后转移到50mL的M9液体培养基中，并在30℃温育12小时。通过在12390g离心10分钟收获培养物，将上清液保存在-20℃直到进一步分析。

松香微生物生产。将质粒pET28a-UGT72B14，pET28a-UGT74R1，pET28a-UGT73B6和pET28a-UGT73C5分别转化成产生肉桂醇的菌株BWT01，分别产生重组菌株BWT02，BWT03，BWT04和BWT05。采用两步培养方法生产松香。在第一阶段，将含有UGT基因的BWT01的重组菌株的单个克隆分别预先接种在LB液体培养基中，并在37℃下以200rpm摇动培养过夜。然后将不同菌株的1mL培养物分别转移到50mL的LB液体培养基中。当OD600达到0.6-0.8时，向培养基中加入0.1mM IPTG，以在200rpm下摇动，在16℃下诱导基因表达12-16小时。在第二阶段，通过以3220g离心10分钟收集细胞，随后将其重新悬浮于50mL的M9培养基中。第二相的培养在30℃下以200rpm摇动持续48小时。以定期时间间隔取样品进行LC-MS分析。

松香纯化。将1升重组菌株BWT05与质粒pCDFDuet-AtCCRPc4CL-AtPAL和pET28a-UGT73C5的发酵液离心收集上清液。上清液被大孔吸附树脂吸附。然后使用不同浓度的乙醇（5,10,20,50和60％）逐渐洗脱目标化合物。每个级分的洗脱体积保持恒定在1柱床体积（BV）。通过HPLC测定洗脱液中松香的浓度。通过真空旋转蒸发器将含有松香的级分浓缩至干。将粗提物重悬于3mL甲醇中。通过在具有SPD-20A检测器的Shimadzu LC-6 AD上进行的半制备型HPLC进行松香的纯化。分离松香的洗脱条件如下：溶剂A，H 2 O;溶剂B，甲醇;流量，4 mL / min; 0-15min，60％A和40％B，16-20min，60％A和40-80％B（线性梯度）。使用YMC-pack ODS-A（10times;250mm;粒径=5mu;m）进行化合物分离。在UV = 254nm监测洗脱。

化学分析与定量。使用Agilent 1260系统与1260 Infinity UV检测器和配有ESI电离探针的Bruker microQ-TOF II质谱仪，通过LC-MS分析重组菌株的次级代谢物。使用Innoval C18柱（4.6times;250mm;5mu;m粒径）进行HPLC分析。肉桂醇和松香的洗脱条件如下：溶剂A，H 2 O（含0.1％甲酸）;溶剂B，甲醇;流速1 mL / min; 0-5分钟，80％A和20％B，6-25分钟，80％A和20％B至100％B（线性梯度）。所有这些产品都在254 nm处被检测到。以正离子模式进行MS分析。通过肉桂醇（商业标准）或松香（纯化产物）的HPLC分析制备标准校准曲线。所有实验一式三份进行，重复至少两次。产量以平均值plusmn;SD表示。

NMR分析。 NMR实验在Bruker Avance 400（Karlsruhe，Germany）上进行。将样品溶解在500mu;L的CD 3 OD中。化学位移以delta;（ppm）表示，偶合常数（J）以赫兹（Hz）表示。

1H NMR (400 MHz, CD3OD) delta; 7.43 (2H, m, H-3′, 5′), 7.31 (2H, m, H-2′, 6′), 7.25 (1H, dd, J = 5.0, 3.7 Hz, H-4′), 6.70 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-3), 6.39 (1H, dt, J = 16.0, 6.3 Hz, H-2), 4.55 (1H, ddd, J = 12.8, 5.7, 1.6 Hz, H-1a), 4.38 (1H, d, J = 7.8, Hz, H-1Prime;), 4.34 (1H, ddd, J = 12.8, 6.5, 1.4 Hz, H-1b), 3.90 (1H, dd, J = 12.8, 2.4 Hz, H-6Prime;a), 3.70 (1H, dd, J = 11.9, 5.5 Hz, H-6Prime;b), 3.25-3.41 (4H, H-2Prime;, -3Prime;, -4Prime;, -5Prime;). 13C NMR (100 MHz, CD3OD) delta; 69.4 (C-1), 125.3 (C-2), 132.4 (C-3), 136.9 (C-1′), 126.1 (C-2′, 6′), 128.1 (C-3′, C-5′), 127.2 (C-4′), 101.9 (C-1Prime;), 73.7 (C-2Prime;), 76.6 (C-3Prime;), 70.3 (C-4Prime;), 76.7 (C-5Prime;), 61.4 (C-6Prime;) .

结果分析

大肠杆菌BL21（DE3）将肉桂醛转化为肉桂醇。据报道，在NADH或NADPH的存在下，醇脱氢酶（ADH）和醛酮还原酶（AKR）可以催化醛或酮还原成醇。在大肠杆菌中，已经鉴定了许多内源性ADH（adhE，adhP，eutG，yi

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