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基于八元瓜环的pH响应超分子前药胶束用于细胞内药物递送

Yin Wang, Dandan Li, Haibo Wang, Yangjun Chen, Haijie Han, Qiao Jin*, Jian Ji*

浙江大学高分子科学与工程系高分子合成与功能化教育部重点实验室，杭州310027。 传真：（ 86）571-87953729; 电话：（ 86）571-87953729; 电子信箱：jinqiao@zju.edu.cn;jijian@zju.edu.cn

近期相关报道提到了基于八元瓜环构建pH响应超分子前药胶束的首次尝试性实验。 发现了获得的超分子前药胶束能够抑制癌细胞的增殖。 并预计这种简便的策略极大可能会为开发多功能药物输送系统开辟新的途径。

近几年年来，由于持续发现和合成了不同的大环宿主分子，医学应用超分子化学的研究也已经大大增加 。因此，设计了各种类型的智能药物纳米载体，包括高分子胶束，纳米胶囊等一系列改善药物释放的前药系统。 智能药物递送系统，高分子胶束仍然是生物医学应用中的简单有效的平台，因为它们的疏水性隔室可作为药物仓库，存储适当量的药物，作为药物的有效载体 。 但是问题依然存在。 其中之一是胶束的随机分解和有效载荷的过早释放，因为当胶束注入体内时，胶束会高度稀释。 因此，为了提高药物输送的效率，降低对正常组织的副作用，提高胶束的稳定性是非常重要的。一个理想的药物传递系统应具有以下功能：（1）可提高化疗药物的水溶性；可延长药物的体循环时间；可减小化疗药物对正常细胞的毒性；（2）载药纳米粒可通过增强的渗透和保留作用（EPR）在肿瘤部位浓集；（3）可在表面修饰可与癌细胞表面过度表达的抗原特异性结合的靶向分子，从而达到主动靶向的目的；（4）可在肿瘤细胞内快速释放药物 。为了实现以上功能，研究工作者们进行了大量有关纳米载药系统的研究 。其中，由于胶束载药系统具有提高化疗药物的水溶性、延长体内循环时间以及通过增强的渗透和保留作用（EPR）增加化疗药物在肿瘤部位的浓集的优点而得到了广泛深入的研究 。

解决上述问题的一个有效策略是将药物分子与形成前药胶束的聚合物结合^[9]。据报道，前药胶束不仅可以增加胶束的稳定性，而且可以提高胶囊中胶囊的数量^[10-12] 。然而，大多数报道的前药胶束是基于相对耗时和费力的合成程序。最近，非共价弱相互作用由于其动态可调性质和功能基团的简单实施而被用于构建智能胶束。已知八元瓜环结构（CB [8]）能够在其腔内同时封装两个客体分子，形成稳定而动态的三元复合物^【13】 。通过上述独特的主体—客体结合特性，CB [8 ]最近被广泛用作连接基序以制备超分子聚合物胶束，动态水凝胶，微胶囊，和核 - 壳聚合胶体^【14-17】 。令人惊奇的是，迄今为止，很少有人注意到使用CB [8]介导的宿主超分子化学制备前药胶束。另一方面，纳米载药系统具备尺寸优势、靶向特性表面多功能性，能改善传统化疗药物缺陷，对于用于药物递送的智能纳米平台，它不仅应该具有在循环期间内保持有效载荷的能力，而且在到达目标部位之后也要能有效地释放有效载荷。在研究较多的情况下，沿着内吞途径的各种组织和细胞区域内发生明显的pH变化^【18-20】 。此外，体内不同组织、细胞及细胞器的 pH 有所不同。如消化道中胃液呈酸性, 而肠液呈弱碱性 ;正常组织的 pH 大约为 7.4 ,而肿瘤组织的 pH 为6 ～ 7 ,明显低于正常组织 ,细胞内的内涵体的 pH 值更低(约 5.6) ^[19]。利用这种 pH 环境的差异可设计出众多针对特定器官或肿瘤组织进行传递的 pH 敏感载体, 以达到特定部位高效传递的目的。其中胶束最有可能在细胞内化的条件是当内体和溶酶体的pH值在5.0-5.5甚至更低的时候，因此这样的pH响应特性提供了合成新型超分子前药胶束的可能性。

基于上述考虑，我们首次报道了使用CB [8]作为超分子连接剂在水性介质中组装两个不同的片段的pH响应性前药胶束的制备（方案1）。 以这种方式形成的胶束是衍生自三元非共价络合物的新颖例子，它可以帮助前药胶束在达到目标之前稳定有效载荷。 在内化入癌细胞后，促使预期的多柔比星（DOX）在内/溶酶体pH下从骨架切割，并抑制癌细胞的增殖。

为此，在实验中我们合成了萘末端聚（乙二醇）（PEO-Np）和甲基紫精功能多柔比星（MV-DOX）。详细的合成方法显示在ESIdagger;（方案S1）中。由于CB [8]能够同时结合形成1：1：1三元复合物的两个客体基团，PEO-Np，MV-DOX和CB [8]以等摩尔比在水溶液中混合。为了阐明宿主 - 复合物之间的形成，过程中使用到1 H NMR光谱和UV / vis光谱。如图所示。如图1A所示，根据含有三元复合物的溶液显示的1H NMR中图像，次现象可以归因于MV的峰的高场偏移以及低场偏移都分配给了CB【8】的峰。此外，在UV / vis光谱中可以发现，三元复合物具有在550nm附近具有峰值，这样表明了显著的电荷转移带^【21】 。此外，对于三元复合物，在260nm附近也存在红色偏移，与该溶液含有PEO-Np和MV-DOX（图S6，ESIdagger;）有关。这些结果则一起表明PEG-Np和MV-DOX可以通过CB [8]连接在一起。

首先，证明DOX形成胶束的必要性。发现PEG-Np，N-（10-巯基癸基）-N0-甲基-4,40-联吡啶鎓氯化物（MV-SH），甚至不含DOX的三元复合物（PEG-Np @ CB [8] SH）不能形成胶束（图S7-S9，ESIdagger;）。因此，作为疏水嵌段的DOX是胶束形成所必需的。其次，由于制备的三元配合物具有PEG的亲水性部分和DOX的疏水嵌段，因此它是两亲性的，应该能够自组装成水中的纳米组合物。为了证实这一过程，应用了动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）。如图所示。如图1B所示，胶束的Z平均直径为170nm，PDI为0.151。 TEM图像显示胶束的形态通常是具有良好定义的核 - 壳结构的球形。在TEM下观察到的胶束的尺寸为约150nm，其比从DLS获得的胶束略小（图1C）。可能的原因归因于两种测量的胶束的不同状态，即，在由于DOX通过酸不稳定的腙键与MV缀合，预期显示内溶/溶酶体pH敏感的DOX释放。为了研究不同pH对药物释放的影响，进行体外实验，监测DOX量。如图所示。 1D，当胶束在生理条件（pH 7.4）下孵育时，只有9.6％的DOX释放72小时。然而，当pH降低到5.0时，在同一时期释放的DOX超过40％，表明PEG-Np @ CB [8] @ MV-DOX超分子前药胶束对内/溶酶体pH的敏感性。 DOX在酸性环境中的释放速度更快是由于以下原因。 （i）在pH5.0下腙键的切割;因此，DOX可以很容易地从胶束的核心使用; （ii）当DOX从MV断开时，胶束的结构变得松散，这可能有助于DOX的发生.10-12。因此，预期所获得的超分子前药胶束可以减少循环期间过早的药物损失，增强细胞内药物释放，这两者对于有效的癌症治疗肯定是有益的。DLS期间胶束处于肿胀状态，而在TEM下处于干燥状态。

根据上述讨论，超分子前药胶束被推测为不释放有效载荷，直到它们在内化于癌细胞中之后经历酸性环境。为了证明这一点，进行了荧光显微镜和流式细胞术。可以在图中找到。 2表明红色荧光强度随着细长的孵育时间而增加，这表明前药胶束有效地内化到人肝细胞癌细胞（HepG2细胞）中。此外，孵育3小时后，几乎所有的红色荧光都积累在细胞核中，这表明DOX已经从骨架中有效切割并逃逸到内体（图2A-C）。此外，也可以使用流式细胞术发现类似的结果（图S11，ESIdagger;）。因此，上述结果证实超分子前药胶束能够将DOX递送并释放到癌细胞的细胞核中。还应注意，在游离DOX孵育3小时后，在细胞中观察到更强的DOX荧光（图2D）。这种现象可归因于胶束比游离DOX较低的细胞摄取率。

细胞内化和pH触发释放之后，另一关键点是DOX分子能否有效杀死癌细胞，并进行MTT测定来说明这一点。如图所示。如图3所示，超分子胶束对细胞产生显着的细胞毒性，而其对应的不含DOX的聚合物前体是生物相容的（图S13，ESIdagger;）。例如，在0.5mg L 1的药物剂量下，细胞存活率大于80％，随着药物量的增加，细胞活力进一步降低。从图中计算出。 3，超分子前药胶束的IC50（即产生50％细胞死亡的抑制浓度）为2.5mg L 1，高于游离DOX（0.7mg L 1）的IC50。然而，当药物剂量升高到更高水平如7.5mg L 1时，超分子前药胶束具有与游离DOX相当的抗肿瘤活性。这些结果表明超分子胶束可以用作肿瘤靶向药物递送的有希望的平台。

总之，我们已经说明了一种基于CB [8]介导的宿主 - 客体相互作用来构建pH响应性前药胶束的简便策略。 三元复合物可以自我组装成具有内切/溶酶体pH敏感性DOX释放的胶束，并抑制癌细胞的生长。 这些属性暗示着癌症治疗的前景光明。 此外，由于CB [8]能够同时约束两位客人，它为我们提供了将不同功能组合成三元复合体的机会，可用作制备多功能纳米载体的通用方法。

此研究在NSFC-21174126，NSFC-51333005，NSFC-51303154，国家杰出青年科学基金（51025312），中国国家基础研究计划（2011CB606203）和中国高等教育博士研究基金资助 （20110101110037和20120101130013）和超分子结构材料国家重点实验室开放项目（sklssm201316）得到了广泛的认可。 我们非常感谢青叶3D绘图为手稿准备的有益讨论。

图1 MV-DOX和CB前药在DMSO-d6中的1 H NMR光谱（A） 由绿色点标记的峰被分配到CB [8]; DLS图（B）和超分子胶束的代表性TEM图像（C）; 在不同的pH条件（D）下，在超分子前药胶束中在体外释放DOX。

方案1 超分子前体药物制备示意图胶束和DOX在内源/溶酶体pH刺激下的控制释放。

图2 与前药和游离DOX（10mg mL 1）孵育的HepG2的荧光显微镜图像。 从左到右：DAPI（蓝色），DOX（红色）和两个图像的合并。 （A）前药1小时; （B）前药，3小时 （C）前药，5小时; （D）自由DOX，3小时。

图3 用不同浓度的前药胶束孵育48小时的HepG2细胞的细胞活力。

Supporting部分

实验详情：

单乙氧基聚（乙二醇）（PEG，Mn = 2.0kDa）

购自Sigma-Aldrich，并在干甲苯存在下通过共沸蒸馏干燥。 2-萘乙酸 由阿拉丁工业公司提供。 6-马来酰亚氨基己酰基多柔比星（Mal-DOX）1和N-（10-巯基癸基）-N-甲基-4,4-联吡啶鎓氯化物（MV-SH）2根据文献合成^【22】。 所有其他试剂和溶剂均为分析纯，无需进一步纯化即可使用。

萘末端聚乙二醇（PEO-Np）

向干燥的三颈烧瓶中加入PEG（3g，0.6mmol），2-萘基乙酸（0.13g，0.7mmol），DCC（0.144g，0.7mmol），DMAP（24mg，0.2mmol）和20mL 无水DCM。 完全溶解后，使反应发生48小时。 然后将溶液过滤，然后蒸发至干。 将固体溶于少量甲醇中并重结晶得到产物。 在该过程重复三次后，将固体在真空中干燥。

甲基紫精合成多柔比星（MV-DOX）

使用Mal-DOX和MV-SH之间的硫醇 - 马来酰亚胺反应制备MV-DOX。 将Mal-DOX（0.45g，0.6mmol）和MV-SH（0.31g，0.75mmol）加入到含有10mL甲醇的烧瓶中。 完全溶解后，通过一滴三乙胺催化反应，使其发生24小时。 通过沉淀溶液获得红色固体产物，加入乙腈中并在30℃真空干燥24小时。

超分子前药胶束的制备

将PEO-Np，MV-DOX和CB [8]以等摩尔比加入到10mL去离子水中。 超声处理一段时间后，将所得溶液剧烈搅拌12小时。 然后将胶束溶液对水透析1天（MWCO = 3.5kDa），并通过1mu;m微孔过滤器去除灰尘。 为了测定DOX含量，将1mL胶束溶液冻干，并用1N HCl处理24h。 用蒸馏水将溶液稀释至10mL。 然后使用荧光光谱法（lambda;ex= 480nm，lambda;em= 560nm，狭缝宽度= 10nm）。

DOX从超分子前体药物系统中的控制释放

控释实验在37℃在不同pH（pH 7.4,5.0）的PBS缓冲液中进行。 通常，将1mL前药溶液转移到透析袋（MWCO = 1kDa）中，并在搅拌（120rpm）下浸入含有10mL PBS的罐中。 在预定的时间间隔，从外部溶液中取出2mL液体，然后用相同体积的释放介质代替。 使用荧光光谱法（lambda;ex= 480nm，lambda;em= 560nm，狭缝宽度= 10nm）检测药物浓度。 进行实验。

细胞培养

用高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）培养人肝细胞癌细胞（HepG2细胞）。 细胞生长培养基补充有10％胎牛血清，100UmL-1青霉素和100mg mL-1链霉素，并在37℃下在5％CO 2潮湿的环境。

细胞毒性测定

通过标准MTT法检测

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