通过从头诱导分生组织进行植物基因编辑

原文作者 Michael F. Maher等 单位 美国明尼苏达州圣保罗明尼苏达大学植物与微生物生物学系等

摘要：植物基因编辑通常是通过向培养物中的外植体递送诸如Cas9和单向导RNA的试剂来进行的。然后通过暴露于各种激素来诱导编辑后的细胞分化为完整植物。通过组织培养创建经过编辑的植物通常效率低下，费时，仅适用于有限的物种和基因型，并且会导致基因组和表观基因组发生意外变化。在这里，我们报告两种通过从头分生组织诱导产生基因编辑的双子叶植物的方法。发育调节剂和基因编辑剂被输送到整个植物的体细胞中，这会诱导分生组织产生具有目的DNA修饰的芽，并将基因编辑传递给下一代。从头诱导基因编辑的分生组织回避了组织培养的需要，并有望克服植物基因编辑的瓶颈。

介绍

植物的生长是由称为分生组织的干细胞来维持的，这些分生组织位于生长的顶端。芽顶分生组织是包括叶子和花朵的所有地上器官的祖先。分生组织的身份是由发育调节剂(DR)决定的；在拟南芥中，它们包括WUSCHEL(WUS)，SHOT MERISTEMLESS(STM)和MONOPTEROS(MP)^[1]。由于植物细胞具有全能性，并且可以转分化为其他细胞类型，因此体细胞中特定DRs组合的异位表达具有诱导分生组织的潜力。例如，在拟南芥中，当WUS和STM或MP的不可抑制变异(Delta;MP)在叶细胞中表达时，生成分生组织样结构^[2,3]。DRs与植物生长调节剂（尤其是激素细胞分裂素和生长素）协同工作，以建立和维持分生组织身份^[1]。在某些双子叶植物中，细胞分裂素生物合成基因异戊烯基转移酶(ipt)的异位表达足以诱导芽器官发生^[4,5]。

植物体细胞中特定DRs的表达可以诱导其他发育程序。在玉米和高粱等单子叶植物中，玉米(Zea mays)Wuschel2(Wus2)和Baby Boom(Bbm)的表达促进体细胞形成，发育成完整植物的胚胎^[6-8]。与Wus2和Bbm共同提供转基因可加快转基因植物的生产，这种方法避免了使用传统的组织培养法。在传统的组织培养法中，DNA被传递到培养物中的细胞，而植物则通过将细胞暴露于各种激素而再生。组织培养是创建转基因和基因编辑植物的最大瓶颈之一：它只能在少数几个物种中进行，需要长达数月的时间，并且通常会导致基因组发生意外和不可预测的变化^[9]。诱导特定发育程序的分子试剂（例如DRs）的使用是规避传统组织培养方法的一种引人注目的方法。

在此，我们报告，DRs和基因编辑试剂的同时表达，通过从头分生组织诱导产生转基因和基因编辑的芽。此外，这些芽产生花朵和种子，最终将转基因和基因编辑传递给下一代。

结果

在幼苗上诱导转基因的分生组织。对于给定的双子叶植物物种，我们认为分生组织将通

图1 |DRs异位递送至幼苗会诱导分生组织。a，Fast-TrACC的第一步是根癌农杆菌培养物的基因转移优化。幼苗在6孔板中发芽，并与优化的根癌农杆菌菌株共培养。大约2周后，开始形成深绿色的组织，并最终产生芽状结构。然后诱导芽状生长形成根。b，如荧光素酶表达所证明的，Fast-TrACC可有效地将转基因传递至幼苗。c，当通过Fast-TrACC递送DRs，例如Wus2和STM（补充图1）时，在高转基因递送位点形成球状生长。d，e，一些生长发育成具有明确组织的分生组织状结构，例如小叶和茎。d所示的生长在b所示的橙色圆圈标记处的幼苗上形成。f，为了确定哪些DRs组合最有效地产生了新的分生组织，将每个带有单个DR的根癌农杆菌菌株库共递送至幼苗（补充表2）。五种组合产生了新生的分生组织，随后产生了植物。

过DRs的不同组合得到最佳诱导。为了确定这些组合，我们开发了一个高通量平台，在该平台中，根癌农杆菌将在不同启动子下表达不同DRs的构建体并递送至幼苗。我们选择本氏烟草(Nicotiana benthamiana)作为模型植物，因为它易于生长，寿命短（约3个月），并且其DNA传递方法已经建立^[10]。为了感染幼苗，我们修改了一项协议(AGROBEST)，该协议是为根癌农杆菌瞬时转化拟南芥幼苗而开发的^[11]。我们的协议称为Fast-TrACC（快速处理的农杆菌共培养），涉及用两种类型的培养基处理根癌农杆菌培养物2 d，然后再用根癌农杆菌培养幼苗2 d（图1a）。如荧光素酶报告基因的表达所证实的，Fast-TrACC有效地将转基因传递给了幼苗，特别是在子叶的细胞内（图1b）。

使用Fast-TrACC将玉米Wus2和拟南芥STM以及荧光素酶报道分子（补充表1和补充图1a）递送至本氏烟草。选择Wus2和STM是因为已确定它们各自在分生组织细胞分裂和模式中的作用^[12]。而且由于拟南芥中这些DRs的异位表达促进了新生生长的形成^[2]。Wus2从弱nos启动子表达，而STM从三个强启动子之一(35S，CmYLCV或AtUbi10)表达。

可能由于DRs的表达，在表现出高水平的局部荧光素酶表达的区域形成了愈伤组织样的生长（图1c 和补充图1b-d）。许多生长保持在未分化的愈伤组织状态。然而，一部分生长逐渐形成了分生组织状结构，由小叶的产生表明（图1d），最终茎具小叶（图1e 和补充图1e-h）。这些芽状的生长被转移到生根培养基中，并且在大约2周内形成了根，使植物可以转移到土壤中。

在证明Fast-TrACC可用于诱导分生组织之后，我们接下来测试了由强度不同的启动子表达的DRs的不同组合，以确定生产完整植物的最佳组合。将各自携带用于独特DRs的表达盒的单独的根癌农杆菌菌株以不同组合合并，用于幼苗共培养。在测试的十二种组合中，只有五种产生了可以从中衍生植物的生长（图1f 和补充表2）。Wus2和STM以及Wus2和ipt这两种组合产生的芽状生长量是其他组合的五倍，而完整植株的产量大约高出四倍。

我们试图将遗传变化引入到分生组织中，然后产生花朵并将遗传变化传递给种子。由Wus2和STM诱导的从头生长产生的植物（图2a）在叶穿孔中测试了荧光素酶表达，并且在

图2(左) |转基因芽将转基因传递给子代。a，通过从头分生组织诱导产生的植物（5-3）。一些植物显示出扭曲和起皱的叶子，这可能是由于持续的DRs表达所致（参见补充图2）。b，许多植物，包括5-3，都是转基因的，如荧光素酶在叶片中的表达所表明的。c，荧光素酶转基因是如从5-3衍生的荧光素酶阳性幼苗所表明的那样，它可以传播给子代。面板ac中的图像代表了从三种独立转化的植物获得的图像。d，为了确定转基因被传给下一代的频率，使一种荧光素酶阴性植物（4-5）和三种荧光素酶阳性植物（5-2、5-3、1-3）的幼苗萌发。并评估发光。

图3(右) |基因编辑的芽将突变传递给子代。a，DRs被传递到组成型表达Cas9的幼苗中（图1f)；T-DNAs还表达一个靶向烯去饱和酶PDS1和PDS2同源物的sgRNA。大约15％的嫩芽是白色的，这表明它们在PDS1和PDS2中含有双等位基因失活突变。白芽不能长成完整的植物。b-d，一些绿色植物（例如1-7）在两个PDS基因座上都嵌合编辑。来自植物1-7的花朵F4和F6的后代具有三种不同的表型：绿色，绿色和白色嵌合体和白色（b，d）。DNA是从a的白色芽和F4的白色后代（幼苗5和6）和F6（幼苗9和10）。在所有情况下，在两个PDS基因座的两个等位基因中均观察到移码突变。sgRNA靶序列以蓝色显示，预测的Cas9切割位点由垂直线表示，突变以橙色显示。括号中的突变表示在每个等位基因处发现的序列，而没有括号的突变表示相同的双等位基因突变（c）。e，与绿色和白色幼苗相反，嵌合幼苗保留了表达sgRNA的转基因（补充图5）。因此，嵌合现象可能是由PDS1处的持续诱变引起的（请注意，PDS2是双等位基因单bp缺失）。新的等位基因出现在嵌合体中，而等位基因固定在绿色和白色幼苗中，这一事实得到了支持（另见补充数据集）。WT，野生型。

一些植物中观察到了荧光素酶表达（图2b）。一些转基因植物显示出发育异常，例如卷曲的叶子，这可能是由于DRs持续表达所致（补充图2和补充表2），对于过表达Wus2和STM的植物尤其如此。大多数植物，无论其转基因状态如何，均能产生结实的花朵。收集转基因阳性植物的种子并使其发芽，并在所得幼苗中观察到荧光素酶表达（图2c,d)。这表明，可遗传的转基因事件可以通过分生组织的重新诱导而产生。

Fast-TrACC输送方法可以优化其他双子叶植物分生组织诱导的DRs组合。例如，我们测试了Wus2，ipt和STM的组合在番茄幼苗上诱导分生组织的能力（补充图3a）。Wus2和ipt诱导芽状生长，并且可以恢复整个番茄植株（补充图3b）。另外，产生了维持荧光素酶表达的芽样生长（补充图3c,d）。我们希望Fast-TrACC可以用于其他物种，以定义分生组织诱导和转基因芽形成所需的DRs。

除了创建转基因植物外，我们还想确定Fast-TrACC是否可以产生基因编辑的分生组织和将靶向突变传递给后代的植物。在设计用于优化DRs诱导芽诱导的实验中（图1f），处理

图4 |在土壤植物上诱导转基因芽。a，一种产生将遗传修饰传给下一代的新芽的方法。植物生长到顶端和腋生分生组织明显分化为止。去除分生组织，并通过以下方式递送DRs和基因编辑试剂根癌农杆菌。随着时间的流逝，从头进行基因编辑的新芽形成，并将编辑事件传递给下一代。b，由不同DRs组合诱导的芽。标记表型包括畸变的形态（可能是DRs诱导的）和发光。所有组合（全部组合）= Wus2，STM，BBM，MPDelta;和ipt。c，荧光素酶活性鉴定转基因芽。左侧显示了形态变形的叶子的示例。该框突出显示了根癌农杆菌的递送部位；椭圆标识所收集的组织（样品114-1）。右边是明亮的视野和合成图像，显示了所采集样品中的荧光素酶活性。

过的本氏烟草幼苗已转基因并组成性表达Cas9^[13]。除DRs外，转移DNA（T-DNA）还带有一个表达单个引导RNA(sgRNA)的盒，该RNA靶向类胡萝卜素生物合成中涉及的植物烯去饱和酶(PDS)。该基因在本氏烟草中具有两个同源物（Niben101Scf14708g00023.1和Niben101Scf01283g02002.1，以下分别称为PDS1和PDS2）^[14]。由于叶绿素的光漂白，两个PDS同系物的双等位基因敲除预计会导致白色表型^[15]。大约15％的新芽显示出光漂白的迹象，但是这些新芽没有形成完整的植物，并且其活力可能因缺乏叶绿素而受到损害（图3a 和补充表2）。然而，对白芽进行了分子评估，发现两个PDS同源物中均存在双等位基因突变（图3c）。因此，Fast-TrACC可以产生带有基因编辑的分生组织。

用各种DRs组合处理后回收了27株植物（图1f），五种表型正常的绿色植物在体细胞中显示出可观的编辑量（补充图4）。这种基因编辑的频率（大约占植物的18%）与表达Cas9和sgRNA的转基因本氏烟草植物中获得的频率相当^[16]。但是，我们的频率可能被低估了，因为15％的原始芽在两个PDS同源物中均具有致命的双等位基因突变，因此无法传播。从一种绿色植物(1-7)的两朵花(F4和F6)中收集的种子产生了绿色，白色和表型嵌合的幼苗（图3b,d 和补充图5a）。在每朵花的两株白色幼苗中分子评估了两个PDS同源物的靶位点，并且在每个基因的两个等位基因中均观察到了突变（图3c）。绿色和白色的嵌合苗含有转基因（补充图5b），表明嵌合现象是由PDS的持续诱变引起的。这与DNA测序数据一致，该数据显示了在嵌合植物中出现的新突变（图3e）。基于这些集体数据，我们得出结论，DRs和基因编辑试剂的共同交付可产生具有突变的芽，并且这些诱变可被传递给下一代。

在土壤生长的植物上诱导转基因的分生组织。在证明分生组织可以在无菌生长的幼苗上诱导后，我们接下来试图确定是否可以在土壤生长的植物上诱导转基因的分生组织。将组成型表达Cas9的转基因本氏烟草植物修剪以去除所有可见的芽分生组织（图4a）。然后将切割部位用表达DRs组合的根癌农杆菌培养物进行灌注（图4b）。和以前一样，所有DRs表

图5(左) |在土壤植物

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