以QuEChERS法结合多壁碳纳米管和高效液相色谱-串联质谱法测定鲜切蔬菜中六种对羟基苯甲酸酯类残留量

Shuangyu Song ¹ ,Zihao Zhang ¹ ,Nan Zou ¹,Ronghua Chen ¹,Lijun Han ¹,Canping Pan ¹,Yelena Sapozhnikova²

¹ 中国农业大学理学院，中国北京 100193

² 美国农业部农业研究服务东区域研究中心，东美人道600号，Wyndmoor，PA 19038，USA

摘要： 在这项研究中，一种采用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS / MS）的优化的QuEChERS样品制备方法被开发用于分析五种鲜切蔬菜（马铃薯，西兰花，胡萝卜，芹菜，卷心菜）中六种对羟基苯甲酸酯的残基：甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基和异丁基的含量。用乙腈提取均质后的样品，并用新型吸附剂多壁碳纳米管（MWCNTs）清洗。与通常使用的伯仲胺（PSA）吸附剂相比，MWCNTs可去除84-94％的叶绿素并导致更低的基体效应（ME）。选用的对羟基苯甲酸酯经高效液相色谱法分离，用乙腈和0.1％（v / v）甲酸溶液等度洗脱，以三重四极杆质谱联用来测定。该方法的结果表明，回收率在70-120％，RSD lt;20％。校正曲线显示6个对羟基苯甲酸酯类的线性响应中，R2gt; 0.99。我们对收集自中国北京不同农贸市场的五十个鲜切蔬菜样品进行了羟基苯甲酸酯残留物的测量，仅一个样品测试结果为阳性，其对羟基苯甲酸甲酯浓度为81mu;g/公斤。

关键词 ：对羟基苯甲酸酯类； QuEChERS； MWCNTs； 鲜切蔬菜

前言

随着快餐业的迅速发展，近几十年来消费者对鲜切蔬菜的需求迅猛增加。根据国际鲜切农产品协会（IFPA）的定义，鲜切制品是新鲜水果和蔬菜或其组合进行物理形式的改变，但是保持新鲜的状态。这些水果和蔬菜经修剪、去皮、洗涤和切割成100％可食用制品后包装或预包装，以提供消费者高营养、便捷和价值，同时仍然保持新鲜度（http://www.creativew.com/sites/ifpa/about.html）。加工蔬菜和水果可能会导致颜色、质地和风味的下降。为了延长实际保质期，可采用多种防腐剂，包括对羟基苯甲酸酯类。

对羟基苯甲酸酯类是对羟基苯甲酸的烷基酯，作为一种抗菌防腐剂在食品中发挥着重要作用其中对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸异丙酯，对羟基苯甲酸正丁酯和对羟基苯甲酸异丁酯是最常用的化合物。由于其成本低，水溶性高和广泛光谱抗菌性能，它们被广泛应用于食品中，例如肉类和奶制品、海鲜、鲜切蔬菜和其他食品。结果，对羟基苯甲酸酯类的消耗是相当可观的。

然而，研究表明对羟基苯甲酸酯类对人体健康有危害作用。比如，Byford和Zhang的研究显示对羟基苯甲酸酯类的雌激素作用与乳腺癌细胞有关（Byford et al. 2002; Zhang et al.2013）。同时，其他研究也证实了对羟基苯甲酸酯类的雌激素作用并改变激素信号和基因表达（Routledge et al. 1998; Terasaka et al. 2006; Vo et al. 2011; Wroacute;bel and Gregoraszczuk 2014）。Aker（Aker et al. 2016）也报道了对羟基苯甲酸酯类对妊娠期甲状腺和生殖激素的内分泌干扰作用。

由于这些作用，近年来研究人员关注于检测食品中的对羟基苯甲酸酯类化合物。一项调查对谷类产品、肉类、海鲜、鸡蛋、奶制品、豆制品、蔬菜、水果等进行对羟基苯甲酸酯类的评估并采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS / MS）来确定其浓度，几乎所有的食品样品至少含有一种对羟基苯甲酸酯类，总量浓度（甲基-，乙基-，正丙基-，正丁基-，叔对羟基苯甲酸丁酯和对羟基苯甲酸庚酯）的分布范围低于定量限值（LOQ），为2530ng / g鲜重，总体平均值值为39ng/g（Liao et al. 2013）。除了分析食品，孕妇和胎儿暴露于对羟基苯甲酸酯类的研究报道在多民族美国城市人口中，人体脐带血中发现其存在，五种对羟基苯甲酸酯类（甲基-，乙基-，正丙基-，正丁基-和对羟基苯甲酸苄酯）检测浓度为25 ng / L至lt;0.01 ng / L（Pycke et al. 2015）。因此，尽管地区和种族的差异，对羟基苯甲酸酯类的暴露是一个世界性现象。美国食品药品管理局（FDA）已经批准甲基、丙基、对羟基苯甲酸丁酯作为饮料中的合成调味剂和佐剂（21 CFR 172.515），含量不得超过20 mg/kg，这是我们能找到的与食品相关的唯一法规。由于人体普遍暴露于对羟基苯甲酸酯类，更多关于改善分析方法和检测其残留物的研究已经出现。

例如，采用基体分散固相萃取（MSPD）结合气相色谱-质谱（GC-MS）（Djatmika et al. 2016）和加压液体萃取（PLE）结合相色谱法四极线性离子阱-串联质谱（LC-QqLIT-MS / MS）（Han et al.2016a）对海鲜中四种对羟基苯甲酸酯类（甲基，乙基，正丙基和正丁基对羟基苯甲酸酯）进行了分析。血清和人乳中对羟基苯甲酸酯类的测定利用液-液萃取和超声-辅助提取结合HPLC-MS / MS进行。药品（Moreta et al. 2015）、化妆品和食品（Zhang et al.2005）的对羟基苯甲酸酯类残留分析也同步发展。Zhang的研究采用HPLC偶联与化学发光检测，来测定加工食品如橙汁、酱油、醋、苏打水和其他保质期较长且含有较低浓度的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯的食品（Zhang et al. 2005）。

近期，Zhou（Zhou et al. 2015）报道了一种可用于某些蔬菜（萝卜，番茄，甘蓝，豇豆和黄瓜）中18种防腐剂包括4种对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸甲酯，乙酯，正丙酯和对羟基苯甲酸正丁酯）的残留分析方法。样品用20mL己烷-乙酸乙酯（1:2，v/v）和4 mL2mol /L乙酸铵溶液提取，在上清液通过旋转真空蒸发器浓缩之后用初级仲胺（PSA）和无水硫酸镁（MgSO₄）分散固相萃取（d-SPE），随后是用UHPLC-MS / MS分析最终提取物。这种方法分析灵敏度高，但由于样品制备过程中的浓缩步骤，该分析过程非常耗时。

QuEChERS（快速，简便，经济，高效，耐用，安全）方法于2003年被首次报道（Anastassiades et al.2003），已成为检测水果和蔬菜中化学残留物的最流行的方法（Anastassiades et al. 2003; Gonzaacute;lez-Curbelo et al. 2015;Schenck and Hobbs 2004）。在QuEChERS方法中，不同种类的吸附剂，如PSA、C _18、石墨化碳黑（GCB）、氧化铝、氰丙基（Olsson et al.2014）和氨基丙基（Mezcuaetal.2009）可用于d-SPE清洗程序，以消除共同提取的干扰（Gonzaacute;lezCurbelo et al. 2015）。PSA有效去除极性干扰例如脂肪酸、有机酸、颜料等，然而GCB有助于保留色素，但可能导致高基质（MEs）对一些化合物的影响（Gonzaacute;lez-Curbelo et al.2011; Wang et al. 2009; Wilkowska and Biziuk 2011）。

碳纳米管（CNTs）是一种在1991年由Iijima首先报道的新型碳质材料（Iijima 1991）。MWCNTs（多壁碳纳米管）是一种纳米管材料，由于其不同的孔隙率和大的表面积具有优异的吸收能力。MWCNTs已经成功应用于QuEChERS程序，以消除蔬菜基质中农药残留的干扰（Zhao et al. 2012; Fan et al. 2014; Han et al.2016c; Han et al. 2015; Pyrzynska 2011; Qin et al. 2015）。

本研究的目的是开发一个快速，简单和有效的针对代表性鲜切蔬菜中的六种对羟基苯甲酸酯（甲基-，乙基-，正丙基-，异丙基-，正丁基-和异丁基对羟基苯甲酸酯）的残留分析方法。QuEChERS方法和新型吸附剂MWCNTs在样品制备中进行了测试，多壁碳纳米管清理也进行了探究。另外，之前未探究的两种对羟基苯甲酸酯（异丙基对羟基苯甲酸酯和对羟基苯甲酸异丁酯）也包括在方法开发过程中。

材料与方法

材料

超纯水用美国Millipore的Milli-Q水纯化系统制备。HPLC级乙腈和PSA均取自CNW Technologies GmbH（德国）。分析试剂级氯化钠（NaCl）取自Sinopharm Chemical Reagent（中国北京）。硫酸镁取自XilongChemical Co. Ltd.（中国北京）。MWCNTs（平均直径为10-20nm）由Tianjin Bonna-Agela（中国天津）提供。紫外分光光度计（TU-1900）被用于检测紫外线吸收。

对羟基苯甲酸酯标准物（甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基）购自Sinopharm Chemical Reagent，纯度为98.5％。在20-mL烧瓶中以HPLC级乙腈制备1000mg / L单个标准储备溶液。六种目标分析物的标准混合储备液以MeCN制备为100mg / L，用于制备基质匹配的标准物质和设防。所有溶液均存放在-20℃环境下。

样品采集和预处理

包括卷心菜，胡萝卜，芹菜，马铃薯以及西兰花的鲜切蔬菜购自位于中国北京三个不同地区（海淀，西城，东城）的不同超市。每种蔬菜都收集了十个样本。这些鲜切蔬菜使用MJ-BL25B2磨机（Media Ltd.，Beijing，China）进行均质化，并且测试部分用于测定对羟基苯甲酸酯的残留物。所有样品都储存在-20°C直到分析。

样品制备

样品制备基于QuEChERS方法。称量均质化的样品（10.0g）到50-mL离心管中。对于强化实验，将样品加入六种对羟基苯甲酸酯（甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基）的混合溶液中，并使其在室温下放置15分钟。然后，加入10mL乙腈（含有1％甲酸），并使用Targin VX-III多管涡旋振荡器剧烈涡旋1分钟。 涡旋后，依次将1.0g NaCl和4g无水MgSO₄加入管中，立即在冰水浴中冷却。一旦管冷却下来（约3分钟），将它们涡旋1分钟并以3800rpm（2260rcf）离心5分钟。然后，将1mL有机相（上层）转移到2mL微量离心管中，预先称重 5mg MWCNT以及150mg无水MgSO₄。将混合物涡旋30秒，然后以10,000rpm（4472rcf）离心1分钟。将上层通过0.22-mu;m尼龙滤膜过滤到LC自动进样器小瓶中用于HPLC-MS / MS分析。

HPLC-MS / MS条件

使用安捷伦6410B三重串联四极杆HPLC-MS / MS（AgilentTechnologies，USA），其配备有H p L C r e v e r s e - p hs s C 18 C om ln（50mmtimes;2.1mmtimes;3.5mu;m粒径）。流速为0.2mL / min。使用乙腈作为流动相A和作为流动相B的超纯水中的0.1％甲酸以等比例为40:60在9分钟运行进行等度洗脱。使用梯度洗涤程序在每次约30次注射以避免可能发生的鬼峰。质谱在负电喷雾电离（ESI-）的多反应监测（MRM）模式下进行，MRM跃迁和碰撞能的所有参数（列于表1）进行了优化，以获得最高的灵敏度和选择性。