多巴胺水平的昼夜节律调节及多巴胺神经元发育对注意缺陷和多动行为的影响

原文作者Jian Huang,Zhaomin Zhong, Mingyong Wang, Xifeng Chen, Yicheng Tan

摘要：注意力缺陷多动障碍是儿童和成人中最常见的精神障碍之一。同时注意力缺陷多动障碍患者常表现为昼夜异常，其机制尚不清楚。在这里，我们发现，斑马鱼突变体的节律基因period1b（per1b）显示多动，冲动和注意力缺陷行为和低水平的多巴胺，联想人多动症患者。我们发现，昼夜节律钟直接调节多巴胺相关基因单胺氧化酶和多巴胺的神经细胞，并通过多巴胺能对神经元的发展或维护的重要作用，调节他们的人数和在腹侧间脑后结节组织。然后我们发现PER1基因敲除小鼠也显示多动症的症状和多巴胺水平降低，从而显示出高度保守的生物钟在多动症的作用。我们的研究表明，一个生物钟基因中断引起ADHD样综合征。注意力和多动行为的昼夜节律模型揭示ADHD的发病机制和探索诊断和治疗这种常见的精神障碍的新的目标打开的途径。

关键词：注意力缺陷；生物钟；多巴胺；多动；per1b；斑马鱼

引言

昼夜节律产生的生理和行为具有24小时的节奏，在这一过程中起着关键的作用醒睡周期（Dijk和冯尚茨，2005）。昼夜节律紊乱被认为是许多精神病的发病机制的基础障碍，包括狂热般的行为和双极障碍（麦克朗，2013）。注意力缺陷/多动障碍（注意力缺陷多动障碍是成人和儿童中最常见的精神障碍之一。成人，3–影响5%的人口（盖斯勒和莱希，2011）。adhdi表现多动，注意力力不集中，和冲动（肯德尔等人，2008），从而显著损害正常展的学术和社会职能儿童，导致次要问题，如拖欠与药物成瘾，成人（ROuml;SLER等人，2004）。其中一个关键多动症患者临床表现明显多动在睡眠剥夺导致（菲力普等人，2006）。全基因组关联研究（GWAS）多动症患者有牵连的内源性昼夜节律基因时钟为ADHD的危险因素（·苏等人，2008）。携带显性负时钟突变显示狂热行为，包括多动，减少睡眠，降低抑郁样行为，减少焦虑，增加奖励在与多巴胺能活性升高的关系中央被盖区（麦克朗等人，2005；洛宝等人，2007），而昼夜核受体REV-ERB（Nr1d1）基因敲除小鼠也表现出狂热的行为，特别是多动和一个中央状态（Chung等人，2014）。此外，褪黑素节律紊乱和生产对生物钟基因Bmal1和Per2的表达改变似乎是与成人多动症患者（贝尔德等，2012）。昼夜节律影响的机制，然而，注意力力缺陷多动障碍的发病机制还是不确定。斑马鱼（Danio rerio）已被确认为一个模型研究行为的遗传和发育的基础（lieschke和库里，2007），并已显示出它的优越性用于高通量药物筛选行为障碍。整个生物体（rihel等人，2010）。在这里，我们着手建立注意力力缺失多动斑马鱼生物模型行为和调查的昼夜节律的调节作用注意力缺陷多动障碍。我们发现，斑马鱼突变体的节律基因period1b（per1b，人类每一物）显示多动，冲动，注意力力不集中等行为，和低水平的多巴胺（多巴胺），让人联想到人多动症患者。这种斑马鱼模型与昼夜节律节律表明，在人类，啮齿类动物的多动症行为，和斑马鱼都与一个不正常的大系统。per1b行为通过DA代谢关键酶直接调节内生的水平，也通过多巴胺能神经元的发展关键基因可能规范其数量和空间组织。我们也确定PER1基因敲除小鼠显示ADHD症状，DA水平降低，与大相关的失调基因的调控作用，从而推测Per1在在脊椎动物中注意力缺陷多动障碍的行为。昼夜对注意力缺陷和多动行为描述模型为注意力缺陷多动障碍的发病机制提供见解屏幕识别新的诊断和治疗的目标对于这种常见的精神疾病。

材料和方法

所有程序均获苏州大学动物护理使用委员会，并按照政府规定中国。畜牧业和胚胎生产斑马鱼，包括野生型AB的应变和per1b突变系，是提出了在我们的鱼设施按标准协议（韦斯特，1993）。野生型和突变的胚胎进行交配产生，然后提出了28.5°C E3胚胎中。获得幼虫在持续黑暗（DD）的条件下，胚胎在正常的第一次提出光/暗（LD，14 / 10小时）的前3 d龄条件（DPF）激活和夹带的昼夜系统，然后转移到DD的环境。对于核糖核酸的分离，不同阶段的胚胎（每一个4小时）收集并存储在80个角的原位杂交与免疫荧光染色，胚胎或幼虫被固定在4%多聚甲醛（PFA）在PBS中3小时室温（RT）或在4°C过夜，然后用PBS洗地，脱水，并存储在100%甲醇在20°C时使用。

突变体的产生与鉴定

斑马鱼per1b突变体是通过逆转录病毒插入生成方法（golling等人。，2002），即逆转录病毒序列插入的per1b基因第一内含子。per1b突变体的鉴定，双引物增法。如图2a所示，引物P1和P2的插入位点的侧翼分别扩增出预期的430 bp

产品特有的野生型鱼，而突变的产品将6 kb的太长，要与此对引物扩增。引物P3，位于基因组DNA的插入位点左侧，与引物P4，里面的逆转录病毒序列，被用来放大预期对特定的734 bp的PCR产物插入突变。因此，纯合子突变体将有一个单一的734个碱基的带，野生型的鱼一个单一的430BP的乐队，和杂鱼带（见图2b）。实时定量聚合酶链反应采用Trizol（Invitrogen），总RNA提取从50per1b或野生型纯合子的幼虫每4小时从48到140小时后受精（HPF）LD的条件和96–140 HPF的DD条件，和其他组的幼虫的特定阶段或治疗

实时定量聚合酶链反应

用Trizol试剂（Invitrogen公司）的总RNA的提取，在50homozygous per1b或野生型幼虫期，每4 h和48 h到140后受精（HPF）的LD和DD条件96–140 HPF for the幼虫期的状态，和其他组（指定的阶段或治疗。治疗与DNA酶后，3克纯化总RNA，反转录成cDNA。实时定量PCR（qRT-PCR）是在一次与SYBR绿色检测ABI仪器进行steponeplus系统（Invitrogen）。聚合酶链反应的热分布的40个周期。在95°C和60°C的°C下，每个周期为10°C和30°C组，各有三个不同的生物样品（九个）为相应的基因型和发育阶段。所有结果管家基因-肌动蛋白的表达水平。实时荧光定量PCR结果显示，相对表达水平计算的CT法（Vanguilder等人。，2008）。对磷的值进行了计算采用单因素方差分析或学生t检验。

荧光素酶报告检测1698个基点（1489至209个基点）的斑马鱼单胺的片段氧化酶（MAO，ensdarg00000023712）启动子区域包含6个E箱（CANNTG）或1403（1371由BP BP）片段的斑马鱼多巴胺羟化酶（DBH，ensdarg00000069446）启动子区包含7个电子盒被扩增并克隆到荧光素酶中含有载体pGL4.17记者（Promega），并命名为PMAO—空质粒组和pdbh-pgl4，分别。斑马鱼的全长cDNAbmal1b（ensdarg00000035732），clock1a（ensdarg00000011703），clock2（ensdarg00000016536），per1b（ensdarg00000016536），Cry1Ab（ensdarg00000011583），与Cry1Ba（ensdarg00000069074）基因（小林等人。，2000；王，2008）克隆到真核表达载体，分别。在转基因鱼实时荧光监测双荧光素酶报告基因的结构，pdbh-pgl4和pmao-pgl4（描述以上），并进行纯化和线性化，然后注射一种用于产生转基因鱼类的细胞阶段胚胎。F1代幼虫的实时荧光监测一个luminoskan提升仪（Thermo Fisher Scientific）使用双荧光素酶报告基因检测系统（Promega）。结果是由circwave归一化（v3.3）软件（首席人事官等人。，2012）。细胞培养和共转染小鼠成纤维细胞，NIH3T3细胞，进行共转染研究。共转染与荧光素酶实验根据执行协议描述（hampp等人。，2008）。抗体和染色质免疫沉淀13个氨基酸的肽（pssqltqspesdr）被选出来的bmal1b蛋白序列，合成，作为抗原产生基于标准协议的兔多克隆抗体（霍华德和凯捷，2007）。选择了10个氨基酸的多肽。seepahlkeq选择从Period2蛋白质序列。alkagesaev选择从per1b蛋白序列。这些被用来产生根据标准协议的小鼠单克隆抗体（霍华德和凯捷，2007）。bmal1b，Per2，和per1b抗体有效的西方印迹实验。bmal1b和Per2抗体在染色质免疫沉淀（芯片）检测，而per1b和Per2的抗体进行免疫荧光染色实验。

芯片检测，收集在5 DPF的一组200个野生型幼虫交联2%甲醛在室温下30 min，然后1:10 V / V1.25 M甘氨酸添加到阻止交联，其次是PBS洗（3，每10分钟）。按照下列程序进行对制造商的协议（微孔芯片检测试剂盒）。我们用纯化的兔或小鼠IgG（Invitrogen）作为阴性对照。芯片PCR使用侧翼的E盒网站以及引物进行没有侧翼的E盒网站胸径5启动子区域的引物和mao作为控制。全安装原位杂交整个安装在原位杂交进行了描述以前（王等，2007）。简单地说，固定的幼虫在50%用地高辛标记的RNA探针在70°C甲酰胺杂交缓冲液18–20小时硝基四氮唑蓝和5-bromo-4-chloro-3—吲哚磷酸盐（罗氏）进行比色检测。对于每一个在原位杂交实验，10，15的幼虫被使用。至少三个独立的原位杂交实验为每个基因进行了反义per1b探针。

西方墨点分析

斑马鱼幼虫在5天洗鱼水和均质裂解缓冲液作为描述先前（王等人，2011）。蛋白样品用8%的SDS-PAGE分离转移到PVDF膜。后阻断5%脱脂牛奶2 h，PVDF膜与原抗体孵育一夜之间在4角第二天，膜在TBST洗（0.5%吐温20）三次，每次10分钟，然后孵育4小时用抗鼠或抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000；图4）在°C.后四TBST洗涤时间，10分钟，每一个膜进行检测采用化学发光酶底物（热费科学）。

酪氨酸免疫荧光染色抗体

用一组12 5 DPF斑马鱼幼虫进行免疫荧光染色染色。固定幼虫放置在30%蔗糖PBS过夜,然后转移到组织和技术o.c.t.储存在26角的厚的部分

使用低温制备16mu;m（徕cm1850）。免疫荧光法

如下：幻灯片的部分

用PBS（3，每10分钟），其次是PBST（3，每10分钟），最后PBS加0.5% Triton X-100（2，每5分钟）。部分然后分别在PBS 30 3%牛血清白蛋白封闭min和TH抗体孵育（鼠标，1:1000；immunostar）第二天晚上4点，第二天，部分被清洗干净。PBS（3，每10分钟）和PBS加0.1% Triton X-100（2，每5分钟）。切片，然后用二抗孵育（抗Alexa的488；a21202，Invitrogen）为2小时，其次是洗

PBS（6，每10分钟）。玻片封片用DAPI溶液（向量的实验室，h1200）。图像使用蔡司复合显微镜拍摄（Axio成像平方米）用数码相机和处理使用Adobe

PS图象处理软件CS。一项双盲试验是用来计算的数目在腹侧间脑后结节多巴胺能神经元（铂）。

先前描述的小鼠脑的免疫组化（共2011）。2月龄小鼠过量与戊巴比妥钠和灌注生理盐水4%多聚甲醛。固定的大脑cryoprotected 30%蔗糖，切成20M冠状切片上的低温恒温器（徕卡cm1850）。切片孵育有两个主要的抗体混合物（鼠抗日，1:1000；immunostar；兔anti-per1，1:600；图，ab3443）过夜4°C.用PBS洗涤三次后，然后将切片一次抗体（抗小鼠Cy3标记的混合物，1:1000；Invitrogen；和抗兔Alexa 488标记，1:1000 Invitrogen公司）；2小时，用PBS洗涤三次后，切片封片与DAPI溶液（矢量实验室，h1200）。

高效液相色谱分析

测量内源性多巴胺浓度在中国科学院基础医学研究所医学科学。先前描述的协议（兰格等人。，2012）。12成年鱼的大脑（5–6）进行解剖在给时时间（ZT）1和zt15快速冷冻液氮，然后储存在80摄氏度，直到使用。约100幼虫快速冷冻在ZT2（98和122 HPF）和cry2（110和134HPF）。样品储存在80°C，直至使用。高效液相色谱分析，100斑马鱼（50毫克）的幼虫或50毫克成人的大脑在250 L 0.1 M醋酸含有10 M EDTA匀浆，抗坏血酸酸，和焦亚硫酸钠。样品储存80°C直到分析。测量神经递质，包括多巴胺，高香草酸酸（HVA），3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC），去甲肾上腺素（NE），5-羟吲哚乙酸（5-HIAA），在瓦里安进行

北极星可编程二进制梯度HPLC系统（安捷伦）。从西格玛奥德里奇购买试剂。校准曲线通过注入标准样品（大，西格玛奥德里奇，h8502；HVA，西格玛奥德里奇，h1252；DOPAC，Fluka，11569；5-HIAA，西格玛奥德里奇，h8876）五种不同浓度（5，10，20，40，和80纳克/毫升）。相关系数为0.999。

斑马鱼行为分析

长期监测的自发活动。自发活动分析是先前所描述的一些修改。在第四DPF，单一的幼虫被放置在每个7296孔板的威尔斯（36野生型和36 per1b突变体），这允许同时跟踪每个幼虫。幼虫的自发活动连续4天在劳工处的情况下进行了监测使用自动视频跟踪系统（videotrack，观生活科学；或daniovision跟踪系统，Noldus信息技术），记录并分析各虫体的运动使用zebralab3.10软件（观生命科学）或本10软件（Noldus信息技术）。九零六孔被放置在zebrabox / daniovision观察室,在连续

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