通过酵母多糖，激活防御反应并减少桃果实中扩展青霉所引起的蓝色霉菌腐烂

原文作者Qin Yu^a,1, Qian Chen^a,1, Zunwei Chen^a,1, Hongke Xu^a, Mengna Fu^a, Shengchao Li ^a,Huizhong Wang^b, Maojun Xu^b,lowast;

^a College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310035, China

^b Zhejiang Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement and Quality Control of Medical Plants, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310035, China

摘要：通过桃果实中扩展青霉在采后贮藏过程中影响酵母细胞壁制备的部分糖类的防御反应和蓝色霉菌腐烂进行了评价。0.5 mg/L酵母多糖（YS）处理的果实腐烂率显著降低。用YS预处理过的水果中总酚含量和几丁质酶的活性，beta;-葡聚糖酶，苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶显著高于对照果，这表明YS处理激活了水果的防御反应。此外，采后贮藏期间YS引发了内源性一氧化氮（NO）的明显增加，提高了果实的水平。NO专一清除剂2-（4-羧基苯基）-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物（2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide）不仅废除YS触发NO爆裂，同时也抑制YS诱导缓解果实腐烂和防御反应。总之，该数据表明YS可能潜在采后储藏期间减少桃果实腐烂的应用。此外，研究结果表明，YS诱导桃果实缓解衰退和防御反应依赖于内源性NO的生成。

关键词：桃； 酵母多糖； 蓝色霉菌；防御反应

1. 引言

桃果实很容易被病原体感染、易在贮藏期间生理恶化，并在室温下熟化。被扩展青霉所引起的蓝色霉菌是经济上最显著的桃果实采后病原菌之一(Zhang et al., 2007; Yang et al., 2011)。使用合成化学杀菌剂一直是减少采后病害的主要方法(Karabulut et al., 2002)。然而，消费者对食品农药残留的关注，病原体抵抗许多目前使用的农药，增加了发展新战略的必要性，以诱导电阻作为新的技术，用于控制采后病害的桃子(Cao et al.,2011; Liu et al., 2012)。

在自然环境中，植物会遇到一系列病原微生物如真菌、卵菌致病微生物，细菌，病毒和线虫。尽管植物环境中存在大量的微生物，但很少有微生物能够攻击任何特定的植物物种。

植物进化出各种各样的对潜在病原微生物的防御机制，如合成发病相关的蛋白质（PR）和

抗菌制品的积聚(van Loon et al., 2006)。它有很好的特点就是内源性信号转导通路/级联反应在植物调节防御反应中发挥关键作用(Bari and Jones, 2009)。一些信号分子如水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯都参与植物防御反应(Adie et al., 2007; Loake and Grant,2007; Robert-Seilaniantz et al., 2007; Balbi and Devoto, 2008)。近年来，植物中一氧化氮（NO）已成为一种重要的信号化合物，具有多种生物学功能。最近研究表明，NO是植物抗病原菌攻击机理的重要信号。遗传证据表明，硝酸还原酶（NR）双缺失的拟南芥（NiAl nia2）植物变得对细菌-丁香假单胞菌敏感，抵抗力的损失使该突变体不能产生NO响应与细菌攻击(Oliveira et al., 2010)。最近，Lai et al. (2011)报道外源性一氧化氮的应用增强番茄果实对真菌病原体的抵抗力。这些结果表明，NO在植物防御中发挥了重要作用，对病原体攻击，并建议有可能增强抗病能力，并通过调节内源性NO水平降低水果的采后腐烂。

对于许多生物和非生物胁迫如病原攻击，UV-B辐射和金属的毒性来说NO的生成是一种常见的植物防御反应(Besson-Bard et al., 2007; Zhao et al., 2007; Wilson et al., 2008)。以往的研究表明，处理来自病原微生物的诱导子会诱导植物细胞中内源性NO的水平增加(Xu et al., 2005)。最近，据我们报道酵母细胞壁制备的部分糖类引发采后贮藏期间黄瓜果实NO水平的迅速增加(Dong et al., 2012)。考虑到NO是负责调解植物抗病性的，酵母糖类可能引发水果中内源性NO的爆裂，这是假设，就是酵母糖类可能通过引发内源性NO的产生来防止收获后水果的腐烂。然而，关于酵母糖类对采后的桃果实有影响的信息很少，并对内源性NO生成和桃果实采后腐烂性降低的因果关系的明确证据仍然缺乏。

这项工作的目的是调查酵母细胞壁制备的部分糖类的防御反应和扩展青霉所引起的桃果实蓝色霉菌腐烂并评估内源性NO在酵母糖类诱导的防御反应的作用和采后贮藏期间果实腐烂的缓解。

2材料与方法

2.1 水果、微生物及实验设计

桃果实(Prunus persica Batsch cv. Baifeng)是在中国浙江省余杭果园里，进行手工采摘成熟阶段的果实并3小时内送到实验室。果实先挑选出大小、颜色均匀并没有看得见的伤疤和疾病的，然后果实受伤之前用2％（V / V）次氯酸钠消毒2分钟，然后用自来水洗涤后风干。

病原体扩展青霉最初从被感染的桃水果中分离并在25◦C马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，含有从200克煮土豆，20g葡萄糖和1L蒸馏水水20克琼脂的提取物）上培养。用无菌蒸馏水淹没培养出的扩展青霉14天，制备孢子悬浮液。孢子用血细胞计数器技术并用无菌蒸馏水按要求稀释。筛选一百九十五个桃果实，每5个果实做3组重复用来确定收货时的特性（0天），而剩下的180个果实随机分为4组进行一下处理：对照（蒸馏水处理）和0.1、0.5、1毫克/升浓度的酵母多糖（YS）处理。浸在10升的溶液中，20℃的条件下处理5分钟。处理后，把果实放在牛皮纸上，并在20℃中干燥3小时。

处理后，所有的果实在赤道区2的位置上用灭菌针弄伤（深4毫米，直径3毫米），并用15微升扩展青霉孢子悬浮液（1times;105孢子/毫升）接种。空气干燥后，对照和处理过的桃子被分成样品，每一个由5个果实组成，储存在封闭塑料托盘中，保持约95％的相对湿度，并在20℃下培养6天。在贮存过程中，5个水果中的3个样品随机每隔2天被抽出来测量水果腐烂率、病灶直径、总酚含量、NO水平以及几丁质酶（EC 3.2.1.14），beta;-1,3-葡聚糖酶（3.2.1.58），苯丙氨酸解氨酶（PAL，EC 4.3.1.5）和过氧化物酶(POD, EC 1.11.1.7)的活性。

2.2 酵母多糖（YS）的准备

正如Hahn and Albersheim（1978）的描述，用乙醇沉淀法从酵母提取物中分离部分糖类。简而言之，将25克酵母提取物(Langshen Biotech Co., Huzhou, China)溶解在125毫升蒸馏水，随后加入100毫升的乙醇。把溶液放置8℃的冰箱里沉淀4天 ，将上清液倒出。剩余的胶状沉淀物溶解于125毫升的蒸馏水，并进行另一轮乙醇沉淀。将把最后的沉淀物溶解于100毫升的蒸馏水中，用121℃的高压灭菌器灭菌2小时，使用前在8℃的冰箱内保存。总碳水化合物含量的基础上表示糖类剂量，它是通过利用蔗糖作为标准的苯酚 - 硫酸法测定的(Dubois et al., 1956)。

2.3 NO清除剂影响YS诱导引起缓解腐烂和防御反应

特定的NO清除剂2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (cPTIO) 已被广泛用于抑制植物中NO的积累(Delledonne et al.,2001; Xu et al., 2005)。因此，cPTIO是在这工作中用来减少YS处理的桃果实中内源性NO的积累。NO清除剂影响YS诱导NO生成、腐烂率、病灶直径、总酚含量以及几丁质酶、beta;-1,3-葡聚糖酶、PAL和POD的活性，桃果实随机分为4组进行以下处理：0.5 mg/L YS, 0.5 mg/L YS 加 0.5 mM cPTIO (YS cPTIO), 0.5 mM cPTIO (cPTIO)和蒸馏水（对照）。处理，根据上述的方法对果实进行了伤害和接种。

在贮存过程中，5个水果中的3个样品随机每隔2天被抽出来测量水果腐烂率、病灶直径、总酚含量、NO水平以及几丁质酶，beta;-1,3-葡聚糖酶，PAL和POD的活性。根据文献报道和我们的初步实验，选择cPTIO的浓度(Delledonne et al., 2001; Xu et al.,2005)。

2.4 果实腐烂的评价

贮存过程中，外表上可以评价果实的腐烂。当果实上受伤的区域以外有宽度大于1mm的可见的腐烂区，被认为是腐烂果实。腐烂率定义为腐烂的果实/总果实times;100。

2.5 血红蛋白测定法量化NO

NO水平是通过分光光度计在401 nm 和421 nm，转换氧合血红蛋白和高铁血红蛋白后利用消光系数77 mmminus;1 cmminus;1 (A401 HbO2, A421 MetHb)测定和计算的(Murphy and Noack, 1994; Pasqualini et al., 2009)。由Clarke and Higgins (2000)描述的方法来制备氧合血红蛋白。收集并立即在液氮中冷冻不同处理的新鲜桃子。然后，将样品用100mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）和0.6％（W/V）不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮匀浆。提取液通过加入粉末活性炭澄清，并在4℃11,000times;g离心10分钟。上清液通过PTFE微孔滤膜(0.45 mu;m）过滤并立即检测NO。加氧合血红蛋白5分钟前，样品用过氧化氢酶（100 U）和超氧化物歧化酶（100 U）预处理，去除活性氧。为了评价提取过程中NO的回收率，将把室温中释放5mu;M NO的1 mM SNP加入样品中并微孔过滤后测出的回收率范围要75%到80%。

2.6 酶测定

所有的酶提取工艺是在4℃进行。为了测定几丁质酶和beta;-1,3-葡聚糖酶的活性，将1克新鲜组织样品，跟5ml 50mM醋酸钠缓冲液（pH5.0）研磨。PAL是用含有20mMbeta;-巯基乙醇的0.2M硼酸钠缓冲液（pH8.7）萃取的。对于POD，将1g果肉跟5ml 50mM硼酸钠缓冲液（pH值8.7）研磨。提取物将在4℃以10,000times;g匀浆离心20分钟。将上清液用于酶测定。

几丁质酶和beta;-1,3-葡聚糖酶的活性按Abeles等（1971年）的方法测定。几丁质酶活性通过混合2毫升粗酶溶液用和0.5mL 2％（重量/体积）50mM乙酸钠缓冲液染料标记的羧甲基几丁质（pH5.0）中测得的。在40◦C孵育2小时后，将反应物通过加入1.0 M盐酸100mu;L停止后，将反应混合物冷却并离心，在用分光光度计550nm处测定上清液的吸光度。几丁质酶活性的单位被定为催化形成1 nmol product/h需要的酶量。beta;-1,3-葡聚糖酶活性通过在40◦C用1mL的4％（重量/体积）昆布孵育1毫升酶制剂24小时后确定。通过样品在沸水中加热5分钟使反应终止，跟250 L的3,5-二硝基试剂反应后用540nm分光光度计测定还原糖的量。其单位被定为催化形成1mu;mol 葡萄糖 equivalents/h需要的酶量。

PAL是由Zucker (1968)所述的方法测定。测定培养基中0.1毫升酶提取物和1毫升L-苯丙氨酸。在40◦C温育1小时后，通过加入0.2毫升6M HCl终止反应。PAL活性的单位被定为在290nm的吸光度下每小时增加0.01的酶量。POD活性用愈创木酚作为供体和H2O2作为底物所测定(Kochba et al., 1977)。POD活性的单位被定为在460nm的吸光度下每小时增加0.001。

酶提取物的蛋白质含量用Bradford（1976）方法测定，用牛血清白蛋白作为标准。酶的比活性以每毫克蛋白质为单位所表示。

2.7 总酚含量的测定

一克果肉组织在5mL的80％（V / V）冷丙酮研磨，然后将混合物在4℃以10000times;g离心20分钟。上清液被用于测定总酚含量。根据Folin–Ciocalteu的方法测定含量(Slinkard and Singleton, 1977)。结果表示为每克没食子酸当量（GAE）每100克鲜重（FW）。

2.8 统计

使用完全随机设计进行实验。所有统计分析使用SPSS(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)。数据采用单向方差分析（方差分析）。平均分离是由邓肯的多个范围测试进行。Ple;0.05差异是显著的。

3 结果与讨论

3.1 YS处理减少了采后贮藏期间桃果实腐烂

接种P. Expansum后桃果实的青霉病发病率2天内可见（图1），这是跟以前

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