菊花中的黄酮和咖啡酰奎宁酸：潜在丰富的生物活性成分来源

Sha Chen ^a,^* , Jing Liu ^a , Gang qiang Dong ^b , Xue ting Zhang ^a , Yan Liu ^a , Wei Sun ^a , An Liu ^a,*

a 北京中药鉴定与安全性评价重点实验室，中国中医科学院中药研究所，北京东直门内南小街16号，100700，

b 中国无锡安利（中国）植物Ramp;D中心，邮编214115

摘要：菊花品种是世界上最有价值的食用观赏作物之一。然而，菊花的生物化学物质及其形态变异之间的关系和可用性仍然不清楚。我们发展了液相色谱质谱技术，构建了一个光谱标签库，对27个菊花品种和代表性茶叶中的7种咖啡酰奎宁酸、21种黄酮和黄酮醇、4种类胡萝卜素和13种其他化合物进行了鉴定和定量。相关性分析发现，更多的acacetin 7-O-半乳糖苷(23)导致更浅颜色的花，更少的acacetin (43)和山奈酚(44)与黄色的花相关。杭白菊的热水提取实验表明，大部分黄酮类化合物和咖啡酰奎宁酸在30 min时溶出，分别为20.977和8.958 mg/g GW，表明用于食品和茶叶的杭白菊富含黄酮类化合物和类胡萝卜素。这些结果提高了我们对类黄酮生物合成和花色机制的理解。

关键词：菊花；液相色谱-质谱代谢组学；咖啡酰；奎宁酸；类黄酮花色

1.介绍

菊花原产于中国，被认为是世界上最有经济意义的“食物和药物两用”植物之一(Boase, Miller, amp; Deroles, 2010; Guo, Tao,Cheng, Wen, amp; Liang, 2008; Li et al., 2016)。菊花消费的增加不可避免地导致其栽培和繁殖的增加，其目的是增加菊花中活性成分的量(Avula et al., 2014; Chu, Fu, Guan, amp; Ye, 2004; Lai, Lim,Su, Shen, amp; Ong, 2007)。在悠久的栽培历史中，有许多种药用菊花，包括杭菊、贡菊、滁菊、博菊和怀菊，在《中国药典》(2020年版)中统称为“菊花”。

由于菊花品种的外观、颜色和香味的相似性，不可避免地出现了故意掺假和无意混淆，导致菊花资源的管理和保护存在许多漏洞(Liu, Wang,Tian, amp; Dai, 2019)。此外，化学图谱已被用于区分栽培品种，如肉苁蓉和茶(Zheng, Jiang,Wu, Wang, amp; Huang, 2014)。在其它植物中也报道了可食用部分中的表型和代谢信息之间的相关性，例如玫瑰花和苦荞种子(Wan et al.,2019; Yang et al., 2020)。菊花的内在品质，如颜色和香味，是由于次生代谢产物的遗传、生理和生态特性的变化而产生的。

公认菊花的主要生物活性成分包括咖啡酰奎宁酸、黄酮和类胡萝卜素，它们具有抗炎、抗菌、抗真菌、抗螺旋体、抗人类免疫缺陷病毒和抗氧化的特性(Xie, Zhang, Zhu, amp; Han, 2015; Xue et al.,2016; Yang, Yang, Feng, Jiang, amp; Zhang, 2018; Zhong, Jiang, Zheng,Ning, amp;Pharmacy, 2014)。虽然菊花主要作为茶食用，但很少有研究调查溶解在热水中的菊花提取物的成分对健康的益处。此外，茶产品的有机溶剂提取物和热水提取物之间的差异是有限的。

到目前为止，几乎没有关于不同发育阶段的杭白菊代谢物谱的信息。成熟期和开花期影响菊花的形态和产量，生产上常用10%开放期和100%开放期。许多植物的收获期，如半夏、陈皮和厚朴，是季节性的，而成熟期和开花期(Roby, Sarhan, Selim, amp; Khalel, 2013)对生物活性成分的影响发挥重大。因此，了解不同花期的桑叶中生物活性物质的种类和含量有助于确定最佳采收期。

花色是菊花形态的一个重要属性。黄色菊花的色素由黄酮和类胡萝卜素组成，白色菊花的色素由黄酮组成，红色和紫色菊花的色素由花色素苷和其他黄酮类组成，橙色菊花的色素由类胡萝卜素、花色素苷和其他黄酮类组成。(Park et al. 2015) 报道称，含有大量花青素的菊花呈现出各种各样的红色和紫色。类胡萝卜素含量较高的呈黄色和绿色。然而，菊花次生代谢产物与其颜色变化之间的关系仍不清楚。

近年来，代谢组学已成为全面分析植物和草药中代谢物的有力工具(Duan et al.,2012; Okazaki amp; Saito, 2012)。包括高效液相色谱(HPLC)、液相色谱质谱(LC-MS)和核磁共振谱(NMR)在内的几种分析方法由于其高灵敏度和准确性而得到广泛应用(Hegeman, 2010; Jorge, Mata, amp; Antoacute;nio,2016)。

在这项研究中，UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS和其他多反应监测(MRM)通道被用于同时检测和鉴定。具有代表性咖啡酰奎宁酸、类黄酮和类胡萝卜素三个不同花期的桑叶茶和27个桑叶茶品种。这27个品种包括26个食用和药用品种，1个观赏品种。此研究还探索了花色与这些成分的关系。我们的研究将有助于阐明不同菊花的不同活性成分，并为菊花颜色形成的机理提供新的见解。

2.材料和方法

2.1.试剂和化学品

用于ESI-MS分析的乙腈是MS级的，从适马·奥尔德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯)获得。从CNW(德国)获得的甲酸也是MS级的，是ESI-MS分析中使用的洗脱剂添加剂。分析级甲醇购自北京化工厂(中国北京)。标准绿原酸(编号110753-2000413，gt; 98%)，咖啡酸(编号BCY-000478)，1，5-二咖啡酰奎宁酸(编号BCY- 10041042，gt; 98%)，4，5-二咖啡酰奎宁酸(编号250036-201907，gt; 98%)，1，5-二咖啡酰奎宁酸(编号BCY-10041042号，gt; 98%)，3，4-二咖啡酰奎宁酸(编号BCY-10041002)，3，5-二咖啡酰奎宁酸(编号BCY-10031122)、槲皮素(编号BCY-000864)、芦丁(编号BCY-0411)、山奈酚3-O-葡萄糖苷(编号BCY-0094)、异鼠李素(编号BCY-000160)、木犀草素-7-葡萄糖苷(编号130074- 201909)、木犀草素(编号BCY-000544)、芹菜素(编号170072)。

2.2.植物材料和样品提取

从27个栽培品种中采集了处于3个不同开花阶段的菊花头状花序:10%开放、70%开花和100%(完全)开花。补充表S1提供了这27个品种的详细资料，包括4个杂交品种:“金菊1 ′( ZY 1号)”和“金菊2′′(ZY-2号)、“晋州3′′( ZY-3号)和“晋州4 ′( ZY-4号);6杭菊品种:“小洋菊”(ZY-5)、“小杨菊2′′(ZY-6)、“大白菊”(ZY-7)、“大洋菊”(ZY-8)、“九月菊”(ZY-9)、“红新菊13′′(ZY-10)；杭菊2号品种4个:“射阳红心菊”(ZY-11)、“射阳小白菊”(ZY-12)、“射阳大白菊”(ZY-13)、“射阳长白菊”(ZY-14)；2个地方品种:“早花1号”( ZY 15号)和“麻城本地菊”( ZY-16);1个贡桔品种:“早贡菊”(ZY-17)，1个博菊品种:“大博菊”(ZY-18)；3个黄色品种:“射阳大黄菊”(ZY-19)、“黄药菊”(ZY-20)、“小黄菊”(ZY-21)，6个特色品种:“# 1 ′( ZY-22)、“# 2 ′( ZY-23)、“# 3 ′( ZY-24)、“# 4 ′( ZY-25)、“# 5′′(ZY-26)和“# 6′′(ZY-27)”。所有植物都生长在无锡安利中国江苏省植物研发中心(无锡，北纬31° 57′，东经120° 30′)。将加工过的花头快速冷冻并储存在80°C，直到提取和分析化合物。在液氮中快速研磨花朵后，精确称出0.3000 g粉末样品。将所有用于提取成分的样品溶解在3 ml甲醇、水和甲酸(70:28:2，v/v/v)混合15 min，超声处理40 min，并以4000 rpm/min离心15 min。在液相色谱质谱分析之前，收集上清液并通过0.22 nm微孔过滤器(Alltech Scientific，上海，中国)过滤。

2.3.菊花茶的加工和提取

新鲜采摘的菊花(ZY-2)立即在100℃通风烘箱中微干燥1 min，然后在65℃微干燥，直到达到恒重。

利用先前的热提取条件(Li et al., 2019)，精确称量5 g菊花茶样品，用100°C水提取，然后在10min、30mim、60min和2h。该实验重复进行四次。使用旋转蒸发器(RE52AA，Yarong，上海，中国)在35 ℃干燥收集的上清液，然后再溶解在2 mL水中。在分析之前，溶液通过0.22mu;m的微孔过滤器过滤。

2.4.彩色分解

使用分光光度计(NF555，Nippon Denshoku，日本)测量菊花的颜色。对于每个样品，花是随机挑选的。然后在光源C装置下以2°的视角测量所选的花。使用ColorMate软件(版本5)收集和处理L*、a*和b*的值。L*值描述了亮度颜色，范围从黑色(L* 0)到白色(L* 100)。正的和负的a*值分别表示红色和绿色，而正的和负的b*值分别表示黄色和蓝色(Jean-Franccedil;ois amp; Gonnet, 1998)。

2.5.液相色谱-质谱鉴定和定量的分析条件

使用Agilent Elipse Plus C18柱(孔径2.1 m，长度2.150 mm)对菊花中的代谢物进行分析。在溶剂系统中，洗脱剂A是0.1%甲酸的水溶液，洗脱剂B是作为有机相的乙腈。分离萃取组分的梯度洗脱条件为:0分钟100% A，20分钟5% A，22分钟5% A，22.1分钟95% A，28分钟95% A；流速0.2 ml/min；温度:35℃；注射量:1 L流出液可选择连接到ESI-triple四极杆质谱和ESI-Q-TOF-MS。配备正负模式双ESI电喷雾离子源的Agilent 6540 Q-TOF质谱仪的质量范围设置为50–1000，以获得目标代谢物。在正离子模式下运行的ESI源操作参数和ESI-MS条件是:气体温度:325℃，气体流量(1min^-1):5，碰撞能量电压:20 eV (ESI)，喷雾器(psig): 35，鞘气温度:350℃ .采用内标物(嘌呤和HP-0921)实时修正测得的质量，正离子模式下参考质量在121.0509 m/z和922.0098 m/z，负离子模式下在119.0363 m/z和1033.9881 m/z。三重四极杆线性加速器的电喷雾离子源工作参数离子阱质谱仪(Q-trap)，Q-TRAP 5500 LC-MS/MS系统分别为:源温度500℃，离子喷雾电压(IS)5500 V；离子源气体I (GS I)、气体II (GS II)、碰撞气体和幕帘气体被设置为分别为50、50和30 pt/in²。碰撞能量设定为20 eV。使用1、10和进行仪器运行和质量校准100 mol/L聚丙二醇溶液在捕集器和唇模式下。多离子监测(MIM)扫描用作触发EPI扫描模型的信息依赖采集的调查，并且进行MIM-EPI以筛选在Q1最小CE (5 eV)中分离的代谢物离子。通过改进的MIM-EPI扫描监测的相同代谢物处的相应Q3适用于目标Q3离子。

2.6.统计分析

根据测定的代谢物进行主成分分析(PCA),以鉴定同质组。使用方差最大旋转确定相关因素，用凯泽-迈耶-奥尔金标准(KMO)提取两个最重要的因素。单向方差分析和SPSS version 22.0 for Windows (IBM，Armonk，NY，USA)，以3个发育阶段的27个栽培品种的化学含量作为固定因子，用于评估收获阶段。用SPSS计算次级代谢产物的相关系数。使用Student-Newman-Keuls显著性检验在P 0.05水平上对均值之间的差异进行了显著性检验，该检验也用于检验不同发展阶段之间的差异。

3.结果和讨论

3.1.菊花次生代谢产物的鉴定

我们用不同品种的样品混合物鉴定了菊花中的化合物。通过使用高分辨率UPLC-QTOF- MS进行全扫描，可以准确确定目标化合物的质量。UPLC-QTOF-MS的PI扫描和NI扫描提供了化合物的可用碎片图谱。通过将MS/MS谱图与真正的参考标准品进行匹配，可以鉴定所有化合物。通过准确的质量、MS2的碎片离子和保留时间(Table 1)，共分离出43种化合物，包括7种咖啡酰奎宁酸、21种黄酮类化合物、4种类胡萝卜素和13种其他化合物。

3.1.1.咖啡酰奎宁酸

四种咖啡酰奎宁酸化合物(5，6，8，11，12)已被鉴定，具有相同的分子式C₂₅H₂₄O₁₂。根据这五种化合物的MS2光谱，质荷比515.1处的离子是碎片与离子[M H 162 Da]—质荷比 353.1和[M H 162 Da-162 Da]—质荷比 191.1结合。带有取代基的咖啡酰奎宁酸随着分

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