拟南芥MLK4介导的组蛋白H3T3磷酸化通过FLC/MAF的转录沉默促进开花

作者：Zhen Wang^1,* , Junmei Kang¹, Juan Armando Casas-Mollano^2,dagger;, Yongchao Dou^2,Dagger;, Shangang Jia³, Qingchuan Yang¹, Chi Zhang² and Heriberto Cerutti^2,*

单位：¹Institute of Animal Science, the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China,

²School of Biological Sciences and Center for Plant Science Innovation, University of Nebraska, Lincoln, NE 68588, USA,

³College of Grassland Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China

摘要：酪蛋白激酶I（CK1）是真核生物中普遍存在的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在高等植物开花过程中起关键作用。拟南芥CK1家族成员MUT9-LIKE激酶，如MLK1和MLK3，已被证明可以磷酸化组蛋白H3上高度保守的第三位苏氨酸（H3T3），其修饰与常染色体和异染色体位点的转录抑制有关。本研究表明，MLK4的T-DNA插入突变体mlk4-3开花较晚，而MLK4超表达植株提前开花。经体内体外实验表明。核蛋白MLK4能磷酸化组蛋白H3T3，其催化活性依赖于第175位上的赖氨酸（K175）。MLK4在K175位点的突变不能恢复磷酸化的H3T3（H3T3ph）的水平，也不能互补mlk4-3突变体的晚花表型。进一步研究发现，mlk4-3中的FLC/MAF家族基因FLC，MAF4和MAF5的表达量显著上调。另外，双突变体mlk4-3 flc-3的开花时间早于mlk4-3，表明mlk4-3的晚花表型需要FLC正常表达。染色质免疫沉淀表明，MLK4结合FLC/MAF染色质，并且H3T3ph在FLC/MAF启动子处的占有率与其转录水平呈负相关。因此，H3T3ph在35S::MLK4/mlk4-3植株的FLC/MAF处积累，但在35S::MLK4(K175R)/mlk4-3植物中有所减少。此外，与野生型相比，mlk4-3中FLC/MAF上沉积的RNA Pol II的量明显富集。综上所述，MLK4介导的H3T3磷酸化通过抑制开花负调控因子FLC/MAF的转录来促进开花。本研究揭示了植物特异的CK1，MLK4通过磷酸化修饰组蛋白H3促进拟南芥开花的机制。

关键词：MLK4；组蛋白H3磷酸化；FLC家族基因；开花；拟南芥

引言

开花是植物从营养阶段到生殖阶段的关键的重要转折点，受到多种翻译后修饰的调节，包括可逆的蛋白质磷酸化（Ogiso et al., 2010; Kim and Sung, 2012; Mulekar and Huq, 2014; Zhou et al., 2016）。许多蛋白激酶已经被证实能磷酸化内外开花途径中的关键因子，如激素、糖代谢途径、光信号和生物钟。（Oh et al., 2009; Shi et al., 2014; Jeong et al., 2015; Wang et al., 2018）。其中，酪蛋白激酶，包括酪蛋白激酶I（CK1）和酪蛋白激酶II（CK2），两个进化上不同的丝氨酸/苏氨酸激酶家族，参与调节各种植物的开花时间，包括拟南芥、油菜、大麦、黑麦草和水稻（Shinozuka et al., 2005; Ogiso et al., 2010; Mulekar and Huq, 2012; Nishida et al., 2013; Kwon et al., 2015; Duan et al., 2017）。

作为进化上保守的双特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，CK1家族成员与CK2相反，是单体激酶，广泛存在于真核生物中（Knippschild et al., 2005）。除了典型的CK1，在植物进化过程中还出现了线状特异性CK1（Cerutti and Casas-Mollano, 2009）。在过去的十年中，人们对高等植物中的植物特异性CK1展开研究，特别是水稻和拟南芥（Wang et al., 2015; Zheng et al., 2017; Chen et al.,2018），并且一些已经被证明通过多种信号途径参与开花（Kang and Wang, 2020）。

在衣藻中首次发现了Mut9p后，在拟南芥中发现了4个植物特异性CK1，被分别命名为MUT9P-LIKE KINASES 1–4（MLK1-MLK4）（Casas-Mollano et al., 2008; Wang et al., 2015）。MLK1 - MLK4对植物的生长和胁迫反应是必不可少的，因为mlk四倍体突变体是致命的，且mlk突变体具有多态性缺陷，对渗透胁迫高度敏感（Wang et al., 2015; Huang et al., 2016; Liu et al., 2017）。近年来，MLK已被证明通过磷酸化或干扰开花信号组件来参与开花调控（Pham et al., 2018; Wang et al., 2018）。例如，尽管目前还不清楚MLK是否磷酸化生物钟成分，但所有MLK都与晚间复合体成分EARLY FLOWERING 3（ELF3）共纯化（Huang et al., 2016）。已有两个研究小组发现，MLK，也被描述为光敏蛋白激酶（PPK），与植物色素信号蛋白植物色素相互作用因子3（PIF3）和蓝光受体隐花色素2（CRY2）相互作用并磷酸化（Liu et al., 2017; Ni et al., 2017）。对于光敏色素，晚花的三联突变体ppk123、ppk124和ppk134对红光高度敏感，且表型受到phyB突变的强烈抑制（Ni et al., 2017）。对于隐花色素，其中两个三个突变体ppk123和ppk124对蓝光显示光敏，磷酸化的CRY2水平降低。尽管单个MLK对CRY2磷酸化位点的偏好不同，但4个MLK/PPK都参与催化CRY2的蓝光依赖性磷酸化（Liu et al., 2017）。尤其是mlk4和mlk4的高阶突变体均表现出晚花表型（Huang et al., 2016; Su et al., 2017），表明MLK4/PPK1是及时开花的必要条件。

开花抑制因子FLOWERING LOCUS C（FLC）是一种MADS-box转录因子，通过抑制下游的开花促进基因的表达从而抑制植物开花（Michaels and Amasino, 1999; Lee et al., 2000）。因此，在成花转变中FLC的表达下调。除了春化和自主途径的组成部分（Sheldon et al., 2000; He and Amasino, 2005），FLC转录还受表观遗传修饰所抑制，特别是H3K27me3（Costa and Dean, 2019），它通过多梳抑制复合物2（PRC2）来维持转录沉默。同时，FLC的抑制活性受到蛋白磷酸化的调控。Robertson等人（2008）研究发现，在过表达FLC-FLAG蛋白的转基因植株中，FLC的潜在丝氨酸激酶靶位点突变为拟磷残基，这种植株比野生型早开花，表明通过增强FLC的磷酸化可以抵消开花抑制作用。此前，我们发现衣藻CK1蛋白MUT9p磷酸化了组蛋白H3上的第三位苏氨酸（H3T3ph），该修饰参与了转基因和转座子沉默状态的维持和遗传（Casas-Mollano et al., 2008）。此外，拟南芥MLK1和MLK2调控的H3T3ph富集于端粒区，mlk1 mlk2双突变体表现出端粒异染色质的部分解聚，导致多个重复序列的转录再激活略有增强（Wang et al.,2015）。然而，H3T3磷酸化在开花过程中的作用机制尚不完全清楚。本研究发现MLK4和它的同源物MLK1和MUT9一样，在体外和体内都能磷酸化H3T3。MLK4突变导致整体H3T3ph水平显著降低，而FLC/MAF家族基因表达上调，从而导致开花延迟。此外，FLC/MAF上依赖于MLK4的H3T3ph与MADS box编码基因上RNA Pol II的沉积呈负相关，表明MLK4介导的H3T3ph在FLC/MAF的转录抑制中发挥了重要作用。

结果

MLK4在长日照和短日照条件下促进开花

之前，我们已经对MLK1-MLK3进行了表征（Wang et al., 2015; Kang et al., 2020）。为了研究MLK4的生物学功能，我们筛选了mlk4的两个T-DNA插入系（GK-756G08和SALK_201615c），两个株系在长日照（LD）和短日照（SD）条件下均表现出晚花表型（表1）。选取GK-756G08品系，并根据此前研究将其命名为mlk4-3（Su et al., 2017）。转录分析表明，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）无法检测到完整的转录本，而T-DNA插入位点上游的转录本检测到的强度与野生型相似（图1a，b），表明在mlk4-3中，由T-DNA中断导致的MLK4转录本被截断。接下来实验中，位于T-DNA插入位点两侧的MLK4特异性序列将被用作PCR引物来扩增MLK4。mlk4-3突变体除了开花延迟外，没有表现出明显的异常（图1b-d）。因此，MLK4的突变推迟了拟南芥从营养阶段到生殖阶段的转换，表明MLK4在开花过程中发挥了积极作用。

为了研究MLK4在开花调控中的作用，将N端标记有FLAG和AcV5的MLK4开放阅读框（ORF）置于MLK4原生启动子（翻译起始位点上游1kb）的控制下，并将该结构分别引入到mlk4-3和野生型中。用同位素[alpha;-³²P]标记的MLK4特异性探针（约250bp）进行Northern blot检测，结果显示，与野生型相同，在包含Pro_MLK4::MLK4的mlk4-3（Pro_MLK4::MLK4/mlk4-3）和野生型（Pro_MLK4::MLK4/Col-0）的转基因植物中都检测到MLK4转录本，但在mlk4-3中检测不到MLK4转录本（图1e）。在蛋白水平上，Acv5-MLK4重组蛋白在转基因植物中检测到，但在mlk4-3和野生型中均未检测到（图1f）。MLK4在mlk4-3中的表达互补了晚花表型，而将MLK4引入Col-0则导致了早花（图1g）。在LD和SD条件下，转基因植株与非转基因相比明显早花（图1h，i）。

我们还通过将花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子取代上述构建的MLK4天然启动子，获得了异位表达MLK4的转基因植物，并从mRNA和蛋白水平上证实了MLK4的异位表达（图S1a，b）。与非转基因植物相比，这些转基因植物的开花时间提前（图S1c），佐证了MLK4在开花中的积极作用。叶片生长动力学显示，在LD和SD条件下，4个基因型之间的叶片萌发没有显著差异（图S1d），表明无论MLK4转录水平如何，叶片萌发速度相似。本研究今后以LD条件为主。

表1 两种mlk4等位基因在长日(LD)和短日(SD)条件下的开花时间分析lt;

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 13 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[597793]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word