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摘 要

本课题研究了使用高效液相色谱技术对多肽BC-13的纯化。以高效液相色谱仪为主要设备，通过对其进样量、梯度、色谱柱等条件的改变来制备高纯度的BC-13。进行了3次梯度的调节对比，3种不同进样量的对比，2种不同色谱柱的对比实验。对于没有达到纯度要求的实验，可以进行二次纯化，其纯度为100%大于95%。实验结果表明纯化BC-13的最佳方案：梯度：时间0-5-10-30，乙腈浓度5-10-27-35%，进样量1ml，色谱柱C18 2公分。可以得到纯度为97%大于95%、产量118mg大于100mg。

关键词: 高效液相色谱; 多肽; 洗脱梯度; 制备; 纯化

Purification of Polypeptide BC-13(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)

Abstract

In this study,the purification of polypeptide bc-13 was studied by using high performance liquid chromatography.Using high performance liquid chromatography as the main equipment,the high purity of bc-13.was prepared by the change of the sample size,the gradient, the column and so on.The comparison of the 3 gradient adjustment,the contrast between the 3 kinds of different samples,and the contrast experiment of 2 kinds of different chromatographic columns.For experiments that did not meet the requirements of purity,it can be purified two times,and its purity is 100% greater than 95%.The experimental results show that the best solution for the purification of bc-13:the gradient:time 0-5-10-30,acetonitrile concentration 5-10-27-35%, sample volume 1ml,chromatographic column C18 2 cm,can be obtained with a purity of 97% greater than 95%,the yield of 118mg is greater than 100mg. 

Keyword: High efficiency liquid chromatography; Polypeptide; Eluting gradient; Preparation;

Purification

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 引言 1

1.1研究背景 1

1.2研究意义 1

1.3文献纯化方法 1

1.4课题的主要研究方法 2

1.5实验目的 2

第二章 实验部分 3

2.1实验材料 3

2.1.1主要实验试剂 3

2.1.2主要原料 3

2.1.3实验仪器 4

2.2实验主要设备 4

2.3 BC-13的合成 5

2.4 BC-13的纯化 5

2.4.1称取粗品量 5

2.4.2溶解粗品 5

2.4.3滤流动相 6

2.4.4粗品的分析 6

2.4.5产品制备和分析 6

2.5冻干 7

2.6称量 7

第三章 实验结果与分析 8

3.1多肽的纯化 8

3.1.1粗品分析 8

3.1.2制备 9

3.1.3分析 10

3.2 BC-13的纯化 12

3.2.1粗品分析 12

3.2.2不同梯度的对比 13

3.2.3不同进样量的对比 16

3.2.4不同色谱柱的对比 18

3.2.5二次纯化 20

第四章 结论 22

致 谢 23

参考文献 24

第一章 引言

1.1研究背景

多肽合成过程中，粗品肽中往往有着大量的结构、理化性质与目的产物相似的杂质这些杂质也会使多肽的合成过程中形成缺失肽、分支肽，给后续的纯化增加了难度。为了更好的提高产物的纯度和收率，应该不仅要提高多肽合成效率和所需产物含量，更要使分离方法得到高效提高。目前多肽的制备和分离纯化的主要方法是高效液相色谱法，主要使用高压泵、微粒填料和高灵敏度检测器，具有分析速度快、分离效率高等特点^[1]。

高效液相色谱法在蛋白质、多肽及其它有机分子的色谱分离中普遍应用，其具备较强的分离能力和对样品分析的适用性。HPLC是采用非极性固定相(如C18)和极性流动相（如水、乙腈），使用物质疏水性的不同来进行分离^[2]。

大多数肽类药物有其自身的优点和缺点。其优点在于：大多数肽类药物源于内源性肽或其他天然肽，其结构清楚，作用机制明确。因此，与最常见的有机小分子药物多相比，肽类药物具有高活性、药物剂量、副作用、氨基酸等突出特点。缺点是易降解，半衰期较短，生物有效性差，大多不能进行口服，只能普通注射，需要制定相应的管理，大范围的合成、分离和纯化困难^[3]。

随着仪器分析方法的改进、定量与定性相结合的不断进步的技术、液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱（LC-MS）结合在药物代谢研究技术广泛应用。该方法有灵敏度高，样品量小，具有直观的特点，对蛋白质、多肽药物代谢研究提供了方便^[4]。

1.2研究意义

穿膜肽是小分子多肽，具有穿透细胞膜的能力，可携带比其分子质量大100倍的对宿主细胞无明显毒副作用的外源性疏水大分子进入细胞。穿膜肽存在比如直接渗透到细胞膜的多种穿膜机制，可以通过易位形成的一个临时性的结构和内吞作用介导入膜等^[5]。穿膜肽是近年研究较多的功能性分子，他们能够携带多肽、蛋白质及核酸分子进入细胞内部。在药学和治疗学领域为药物递送及靶向治疗提供了新的研究思路。这些技术一旦应用于临床，必将为疾病诊断，新药研发及提高药物疗效提供有利的手段，具有广阔的前景^[6]。

穿膜肽是目前研究方向的一大热点，我国也进行了一系列的关于穿膜肽结构特点、机制和磨损模型的研究，并取得了很大的成果。所有研究表明，穿膜肽可将多肽、蛋白质、核酸、核糖核酸及超分子颗粒等通过无受体介导、无耗能的方式导入多种细胞中，并不会对细胞在一定浓度范围内造成损害。虽然对于穿膜肽进入活细胞的具体机制暂时不能确定，但肯定是作为生物活性分子的有效的细胞内运输工具。必将在细胞生物学、治疗、药物输送等多个研究领域中发挥着不可替代的作用。随着研究的不断发展，特别是随着穿膜肽的不断发展，我们也可以合成更多的，具有穿膜能力强、毒性小、甚至是非细胞毒性的穿膜肽。用于疾病治疗的其他方面^[7]。

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