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中药对禽毛孢子菌的抑菌作用研究

摘 要

本研究从鸽子囊粘膜上形成的白色假膜和溃疡中分离出一株毛孢子虫，并通过基因测序进行了鉴定。研究了石菖蒲、苦参、水蓼、中草药混合物对该品种的抑菌作用，采用微量稀释法测定了中草药对毛孢子的最低抑菌浓度。研究了中药对毛孢菌感染鸡的疗效，结果显示，石菖蒲的最低抑菌浓度为32mg/mL，苦参的最低抑菌浓度为2mg/mL。水蓼为120mg/mL，中药混合物为36mg/mL。苦参的抗菌效果最好。动物实验结果表明，中药对感染鸡的治疗效果优于氟康唑。中药治疗组死亡率为33.33%，氟康唑治疗组死亡率为46.67%，中药保护组死亡率为23.33%。中药治疗的时间越长，治疗效果就越好。中药治疗组血清和肝脏谷氨酰乙酰化酶值均显著低于非治疗组。结果表明，石菖蒲、苦参、水蓼、中草药混合物对毛孢子菌有一定的抑制作用。提前服用中草药可以保护不受毛孢子菌感染。

关键词： 毛孢菌；鸡；中草药；防护及治疗

第1章 介绍

毛孢菌属最初是由贝格尔在轻度头发感染的患者中发现的。目前，超过50种不同的亚种和大约16种不同的菌株可导致人类疾病(科伦坡等人，2011年；Gorz和Boron，2016年)。它们具有高致病性，分布广泛，存在于空气、土壤、海豚、蚂蚁、甲虫、鸟类、牛和羊（卡法奇亚等人，2006年；古格纳尼等人，2007年；帕格诺卡等人，2010年；德拉文恩等人，2011年；古贾里等人，2011年；上田等人，2017年）。近年来，在健康家鸽、粪便、宠物鹦鹉和狗的胃肠道泄殖腔中发现了毛孢菌(布里汉特等，2010年；Bryan等，2014年；麦地那等，2017年)，可通过污染人类生活环境感染毛孢菌。研究发现，候鸟泄殖腔中的毛孢子虫可引起动物和人类的皮肤或全身性疾病。候鸟是病原体的潜在宿主，在病原体的生态、循环和传播中发挥着重要作用。鸟类迁徙对病原体在不同物种和地区的水平和垂直传播有一定影响（Cafarchia等，2006年；Foti等，2011年）。

虽然关于毛孢菌感染的报道越来越多，但关于毛孢菌的毒力因素、致病过程和抗真菌耐药性机制的报道相对较少。研究表明，毛孢菌对一线抗真菌药物(如两性B(AMB)、氟康唑、伏立康唑、米卡松)有一定的渗透性，耐药菌株数量增加(Bieganskaetal.，2018)，同时耐药性显著增强。针对毛孢菌的研究，研究人员开始探索新的抗真菌药物及其增效剂。奥利维拉等人的研究。表明从两栖木蛙的脂肪组织中获得牛蛙油可显著提高AMB的抗真菌活性，降低其毒性(Oliveiraetal.，2018)。路德维希等人。通过使用纳米技术开发，也可以通过壳聚糖包覆的聚乳酸乙醇酸纳米颗粒实现类似的结果(Ludwig等人，2018)。从蛇毒中提取的响尾蛇胺对带负电荷的细胞膜具有显著的亲和性和抗真菌活性(Masetal.，2017)。抗菌肽也被认为是一种很有前途的微生物耐药性解决方案(Wimley和Hristova，2011)。.由于合成化合物的副作用，人们对天然产物的研究越来越感兴趣，这逐渐导致了中药研究的繁荣。中药具有多种复杂成分、作用方式不同、剂量小、毒性低，已用于抗真菌治疗。研究发现，石菖蒲能缓解阿尔茨海默病的发病、降低血脂、促进胃肠道收缩、蠕动、抑制哮喘、增强机体免疫，同时具有抗肿瘤、抗抑郁、抗血栓、抗动脉硬化、抗菌（张、沈，2018；张、郭，2019）。苦参对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、四球菌、枯草芽孢杆菌等有一定的杀灭作用，加入水杨酸、黄连、金银花等药物，对真菌手足苔的治疗有一定的杀灭作用(Zhang and Shen，2018)。水蓼的抗菌作用最强，可抑制大肠杆菌、葡萄球菌等多种细菌的生长(Wangetal.，2017)。还有其他中草药，如花椒、鱼腥草、倒酮酸木兰、黄芩苷、海葵等，用于抗真菌治疗（尚，2012；Shietal.，2014；Wu，2017）。本研究从河北省保定的临床病鸽中分离出一株毛孢子菌。为寻找敏感药物，选择石菖蒲、苦参、水蓼3种中草药，探讨对分离的毛孢菌的体内外治疗效果。

第2章 材料与方法

本研究经河北农业大学实验动物伦理委员会批准

2.1 中草药的制备

石菖蒲、苦参、水蓼购自安国东方医药市（中国河北），3种中草药重50克，中药混合物重60克：石菖蒲、苦参、水蓼比例为1：1：1。首先压成粉末，按1：30的比例加入60%的乙醇水溶液（Yi等，2006；唐等，2011；方等，2016；韩等，2018；Xiang等，2019）。中药在室温60%的乙醇中浸泡12h后，在40C下超声3次，每次15min。超声提取的药液在真空吸力过滤瓶中过滤，加入浓度为60%的乙醇，40C超声2次，每次15min，将2种过滤溶液混合，3000r/min离心10min。取出上清液，通过旋转蒸发器浓缩至1.5g/mL蒸发后的液体储存在4℃.

2.2 毛孢子菌的分离

从河北省保定市临床患病的鸽子中分离得到毛孢子菌。解剖患病的死鸽子，观察到白色溃疡和地毯样病变。从载玻片上取病灶渗出物，加入1滴浓度为10g/L的氢氧化钾溶液，热固定后固定在显微镜下，观察是否有孢子或菌丝。将无菌棉试纸浸入病鸽囊内的粘膜中，用生理盐水稀释，应用于沙保罗葡萄糖琼脂(SDA)培养基中，37℃孵育48h，观察菌落的形态特征；连续划线，培养至得到纯培养。对单个菌落进行革兰氏染色，并在显微镜下观察菌丝和孢子的形状。菌株在甘油管中冷冻，并在37℃的SDA中保存，以供以后使用。

2.3 分子生物学鉴定

遵循真菌基因组DNA提取试剂盒的操作程序(由OMEGR提供)。采用真菌通用内转录间隔(ITS)序列引物(ITS1 50-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 0)和(ITS430-TCCTCCGCTTATTGATATGC-50）扩增了5.8 SrRNA和ITS-2，最终体积为50微升，包括5.0微升的10*Taq缓冲液，4.0微升dNTP，2微升ITS1和ITS4,0.5微升Taq，2微升模板DNA，34.5微升ddH2O。他们首先在94℃变性3min，然后进入35个周期，94℃变性30秒，退火57摄氏度30秒，延长72℃1min，最后存储在4℃。PCR获得的产物在1%浓度的电泳琼脂糖凝胶里验证，纯化使用QIAickPCR纯化试剂盒(QIAGEN公司)。纯化后的PCR产物由应用生物系统3730xl测序仪进行测序，其结果通过基于web的爆破程序和基本局部比对齐搜索工具(http://www.ncbi。nlm.nih.gov/BLAST);我们将这些数据与NCBI/GenBank数据库中的数据进行了比较，并使用MEGA7.0构建了一个进化树。

2.4 中药对受感染鸡的防治方法研究

在动物试验中，由河北丁农公司（保定，中国）提供，并经河北农业大学动物伦理委员会批准，按照国家动物福利保护立法进行饲养、管理和解剖。随机分为对照组、中药保护组、中药治疗组、氟康唑治疗组、非治疗组5组。每组30只动物，3组重复组。实验开始前，在相同条件下饲养3天，然后进行真菌感染和处理。

用生理盐水将1.5g/mL的中草药混合物稀释至1g/mL，用生理盐水制备细菌悬液浓度为10⁷CFU/mL。首先，中药保护组的鸡按1mL/kg的体重饲喂中药混合物，灌胃5d。除对照组外，其余各组均连续饲喂0.5mL菌悬液7d，其中中药保护组的鸡连续饲喂中药混合物。7d后，每组随机抽取9只鸡，通过颈动脉出血处死，通过病理解剖和组织学细菌分离检查细菌感染情况。采集血液和肝脏以测量转氨酶。从这些作物中收集到的真菌进行了培养。后续实验中，中药保护组和中药治疗组均按1mL/kg7d体重混合中药鸡，氟康唑治疗组按广东人民制药有限公司提供的氟康唑用药说明书喂养。在研究结束时，所有动物均死亡，病理检查和样本采集与上述方法相同。

2.5 中药体外药敏试验

中药最低抑菌浓度(MIC)根据临床实验室标准协会编制的M27-E4（酵母乳液稀释抗真菌药敏试验参考方法：批准标准-第四版）标准确定。将中药(1.5g/mL)稀释至1024mg/mL、512mg/mL、256mg/mL、128mg/mL、64mg/mL、32mg/mL、16mg/mL，8mg/mL，4mg/mL用RPMI1640培养基，双稀释法。在96孔板中取总计180mL的RPMI1640培养基，包括中草药，每浓度重复2次。阳性和阴性对照加入180mLRPMI1640培养基中。从SDA培养基中取活化菌落，稀释至浓度为5*10³CFU/mL在RPMI1640介质中。阴性对照孔均加入20mL菌悬液，加入20mLRPMI1640培养基；然后将96孔板置于37℃的培养箱中48h，用酶标仪测定各孔的光密度(OD)600值。与阴性对照相比，OD值大于80%的药物浓度为MIC₈₀。本实验重复3次。根据上述试验结果，采用相同的试验方法，进一步用石菖蒲、苦参、水蓼和中草药混合物稀释MIC₈₀。每次试验重复3次。

2.6 对每种草药的药物敏感性试验

将浓度为1.5g/mL的中药加入到SDA培养基中，制成浓度分别为125mg/mL和64mg/mL的中药培养基板。采用相同的方法制备浓度为60%的乙醇培养基板作为对照。用生理盐水制备浓度为10CFU/mL的细菌悬液。总体积100mL的细菌悬液均匀分布在SDA介质板，包括不同浓度的中草药，和SDA介质没有中草药作为对照，37℃培养24h，48h、72h、96h、120h和144h后观察菌落生长，并测量菌落的直径。

按照上述试验结果继续制备浓度为32、16、8、4、2的培养基板，同时制备浓度为1mg/mL的苦参和浓度为32、16、8mg/ml的培养基板。采用相同的培养方法，观察菌落的生长情况，并测定菌落的直径。

2.7 统计分析

所有结果均用均值6扫描电镜表示。通过SPSS软件包V11.5(SPSSInc.，芝加哥，IL)进行统计分析。所有数据均采用单因素方差分析，以确定组间的差异。在本研究中，P为0.05时认为两组差异显著，P为0.01时认为两组差异极显著。

第3章 结果

3.1 病原性真菌的形态学研究

致病性真菌主要生长在鸽子的食道和作物上，在作物的黏膜上发现了白色的假膜和溃疡(图1A)。致病性真菌在SDA培养基上培养48h，形成白色、潮湿和中央凸起的褶皱，以及直径为8-11mm的菌丝分化的生长型菌落(图1B)。革兰氏染色结果为阳性。显微镜下可见蓝紫色圆柱形、桶状关节孢子，长菌丝呈不规则分布。未看到附着细胞、抽吸器或粘附垫（图1C）。

图 1 从病鸽的作物中提取的病原真菌。(A)病鸽子的作物。(B)在SDA培养基上的病原真菌菌落。(C)病原真菌革兰氏染色的形态学。缩写：SDA，沙布罗德葡萄糖琼脂。

3.2 分子鉴定

通过PCR扩增真菌常见的靶基因序列，纯化产物的测序结果与NCBI网站上MF6623899.1、748.1、KJ74858.1、MG2415、33.1、KX233859.1、MH384817.1、MF662355.1、MG737.1、MG733760.1比较。MH865942.1、EF153624.1、KX376270.1的同源性可达到100%。使用MEGA7.0软件进行同源性分析，进化树如图2所示。同源性分析表明，分离出的菌株属于毛孢菌属，菌落的生长形态和孢子特征也符合毛孢菌的特征。

图 2 菌株的系统发育树。“1”是从一只病鸽子的作物中分离出来的菌株。

图 3 毛孢菌感染鸡7 D. (A)毛孢菌感染组的鸡；(B)感染毛孢菌的鸡的排泄物

3.3 中药对感染鸡的预防作用

感染7D后，中草药保护组的鸡仍有食欲，精神状态较好。其他受感染组的鸡则表现出精神抑郁、食欲不振和羽毛松动(图3A)。随着感染人数的增加，体重有所减轻，其中一些人在第五天死亡。感染结束时，病理解剖显示感染组鸡鸡壁出现白色假膜溃疡，层状扁平上皮出现增生、肥大(图3B)。从患病部位的致病真菌进行分离培养，获得毛孢菌纯培养。

毛孢菌感染7d后，中药保护组鸡血液中谷氨酸转氨酶(GOT)含量低于感染组（P0.05），与对照组相似（表1），尤其是中药保护组鸡肝脏GOT含量极低于感染组（P0.01）。对于血液和肝脏中的谷氨酸转氨酶，中药保护组与感染组之间无显著性差异(P。0.05).结果表明，中药保护对毛孢菌感染的鸡肝脏有积极作用。

表 1 毛孢霉感染7D后血液和肝脏的GOT和GPT

a、b、c不同组间的值有显著性差异。A，b值在不同的组中非常显著。缩写：GOT，谷氨酸转氨酶；GPT，谷氨酸丙酮转氨酶。

3.4 中草药的治疗效果

试验鸡经7D用药处理后，除未处理组外，其采食量略有增加，但死鸡数量有所增加。中药保护组和中药治疗组鸡的死亡率均明显低于氟康唑治疗组和非治疗组，但均高于对照组（表2）。中药保护组、中药治疗组低于非治疗组（P、0.05），中药保护组和中药治疗组鸡肝脏GOT极低于氟康唑治疗组和非治疗组（P、0.01）。中药保护组、中药治疗组和氟康唑治疗组的血液和肝脏中谷氨酸丙酮转氨酶含量均无差异(P。0.05）（表3）

表 2 各动物组的死亡率

死亡率=死亡

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