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摘 要

本实验室枯草芽孢杆菌S13菌株具有良好的抑菌活性，本研究通过将碳源和氮源按1：20，1：21，1：22，1：23，1：24，1：25把玉米粉和豆粕粉按其对应的碳氮比计算出所需要的玉米粉和豆粕粉的重量。分别添加等量磷酸二氢钾、七水硫酸镁和硫酸亚铁制成发酵培养液，接种S13菌株1ml后220rpm30℃培养36小时，经系列梯度稀释涂PDA平板测试其发酵效果，结果显示各种不同碳氮比例的培养基所得到的单菌落个数不同其中氮碳比例在1：25效果最好，36小时培养菌落达到6.9×10⁹CFU/ml。

关键词：枯草芽孢杆菌 培养基优化 碳氮比例

Abstract: The laboratory strain of Bacillus subtilis S13 has good antibacterial activity, this study by the carbon and nitrogen at 1: 20, 1: 21, 1: 22, 1: 23,1: 24,1: 25 Maize after the powder and soybean powder their corresponding N ratio calculated by weight of corn flour and soybean flour were needed to add the same amount of potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate heptahydrate and ferrous sulfate into the fermentation broth, inoculated S13 strain 1ml 220rpm30 ℃ cultured 36 hours after inoculation to come up with pre-prepared PDA medium, the series dilution test coating plate fermentation results showed that the number of single colonies of various proportions of carbon and nitrogen obtained by different media which carbon-nitrogen ratio of preferably 36 to 69 hours of incubation colonies at 1:25 effect.

Keywords: Bacillus subtilis medium optimization N Ratio

目录

1 前言 2

2 材料、仪器与方法 2

2.1 材料及试剂 2

2.2仪器 2

2.3 方法 2

2.3.1 凯氏定氮仪对豆粕及玉米粉测试 2

2.3.2 Lb培养基得制备 3

2.3.3优化培养基得制备 3

2.3.4 PDA培养基的制备 3

2.3.5 S13菌株的活化 3

2.3.6 S13配方培养基的接种 4

2.3.7 菌落培养计数 4

3数据分析与讨论 5

3.1结果与数据 5

3.2数据分析 6

3.3讨论 7

4.结论 7

参考文献 8

致谢 10

1 前言

土传病害是土壤中的有害真菌、细菌、线虫和病毒等存留于土壤中，在条件适宜时大量繁殖并从根部或茎部侵染引发的病害^[1-4]。在蔬菜栽培当中，最严重的是有害真菌导致的根部病害^[5-7]。发生会造成巨大的经济损失，传病原物散见于真菌、细菌、线虫和病毒的众多分类单元中，引发包括纹枯、枯萎、黄萎、立枯、猝倒、根腐、青枯、软腐、根结线虫、胞囊线虫、根肿和丛根等在内的众多作物的土传病害^[8]。化学农药因剧毒、 高毒对人畜不安全，使用中会造成土壤和水体污染，目前被大量限制使用或禁止使用，2020年中国农药使用总量实现零增长。开发利用生防菌剂是现在中国急切需要面对和解决的。枯草芽孢是生防菌剂中常用的一类广泛存在于自然界的腐生细菌它们生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆能力的芽孢，在产品开发中有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目^[9-11]。碳和氮源是微生物细胞和代谢产物的重要营养物质, 也是发酵培养基的重要组成部分。发酵培养基配方是影响微生物发酵的重要因素之一。大量研究表明 ,不同细菌对各种营养物质的需求量不同。本研究目的是通过优化发酵培养基的配方, 提高该菌株发酵液的含菌量。本实验室S13生防菌株，前期研究发现其具有良好的生防潜力，能抑制多种病原菌。所以开发利用S13培养基优化与筛选豆粕是作为发酵培养基中为菌株提供碳源氮源的很好的材料，但是由于豆粕粉中含有一定量的蛋白酶抑制剂，且不同菌种对豆粕的利用率不同，所以探索碳氮比，尤其是豆粕比例具有重要的意义，也是该实验所要研究的重要指标。

2 材料、仪器与方法

2.1 材料及试剂

枯草芽孢杆菌、Lb培养基、PDA培养基、豆粕粉、玉米粉、胰蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）、硫酸亚铁（成都市科龙化工试剂厂）、硫酸镁（国药集团化学试剂有限公司）、琼脂条（国药集团化学试剂有限公司）、磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司）、蔗糖（西陇化工股份有限公司）、酵母浸粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）、马铃薯等。

2.2仪器

微波炉 、灭菌锅 、烘箱 、干热灭菌锅 、凯氏定氮仪、生化培养箱、双层全温摇床、超净工作台等。

2.3 实验方法

2.3.1 豆粕及玉米粉含氮量的测定

把过100目筛的豆粕粉和玉米粉分别各放入三组试管，这6组试管每一管中的豆粕粉或者玉米粉都在0.2g左右。然后向这6组试管加入10ml百分之九十八的浓硫酸10ml和半勺催化剂，放到消化炉里消化40分钟，待消化后的这6组试剂冷却至常温就用凯氏定氮仪做凯氏定氮。将得到的三组豆粕粉氮含量和三组玉米粉氮含量取出平均值^[12]。

2.3.2 Lb培养基的制备

胰蛋白胨10g 、酵母提取物5g （以酵母浸膏为氮源时, 无菌滤液的抗菌活性明显高于其它氮源, ） NaCl 10g 琼脂条12g用1mol/l NAOH调节（枯草芽孢杆菌的适宜 p H 范围为 7.0～7.2。）补足水至1000ml.将配制好的LB培养基放在高压灭菌锅中121℃灭菌20min。^[13]

2.3.3优化培养基的制备

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