论文总字数：10306字

摘 要

油菜种子几乎不具有初生休眠能力，但具有不同程度的次生休眠能力。油菜种子的次生休眠会形成大量的地下种子库并且种子库会长期存在。一旦外界环境适宜萌发，次生休眠的种子将会萌发成为自生苗。自生苗的出现将会降低油菜种子的品质，而转基因自生苗又会通过花粉漂移引发生物安全问题。因此，选育次生休眠较弱品种成为减少自生苗的有效途径。然而，到目前为止，次生休眠的遗传基础和分子机制仍不清楚。前期，我们通过RNA-seq手段筛选到BnaHEN1基因在休眠前后表达水平存在明显变化。本研究通过对该基因组织表达模式进行分析，结果显示其在14天种子中表达水平最高，为进一步研究其在次生休眠过程中的功能奠定了基础。

关键词：油菜种子，初生休眠，次生休眠，BnaHEN1基因

Abstract：Rape seeds have little or no primary dormancy, but exhibit different degrees of secondary dormancy. The secondary dormancy of rape seed will form the seed bank in soil and the seed bank will be kept for a long time. Once the external environment is suitable for germination, the secondary dormant seeds will germinate and emerge as volunteers. The emergence of the volunteers will decrease the quality of rapeseed, and the genetically modified volunteers will induce the biosafety problem by cross-pollination. Therefore, it is an effective way to breed cultivars with low secondary dormancy. So far, however, the genetic basis and molecular mechanism of secondary dormancy are still unclear. In the previous study, we screened the expression level of BnaHEN1 gene in dormant seeds by RNA-seq. The results of this study showed that the expression of the gene was the highest in 14 day-old seed after fertilization, which lay a foundation for further study of its function in the secondary dormancy.

Keywords：Rapeseed seed, primary dormancy, secondary dormancy, BnaHEN1

1.前言

1.1引言

油菜作为中国四大油料作物之一，不仅是油和饲料的来源，还是重要的工业原料。油菜种子几乎不具有初生休眠现象，但是具有不同程度的次生休眠特性，而该特性是导致田间自生苗（杂草）和基因扩散的主要原因^[1]。因此，对油菜种子次生休眠特性的研究显得尤为重要。

1.2油菜简介

油菜是十字花科植物，叶大没有叶柄和托叶，花是双性并且具有辐射对称性。果实是长角果。在夏天成熟时，它会裂开并散出种子，种子有紫色、黑色和黄色。它的种子可以用来提取油，所以它与向日葵、花生和大豆并称为中国四大油料作物。此外，菜籽油的蛋白质含量高，含油量高，应用范围广，是我们日常生活和工业运作中不可缺少的作物。

油菜在中国种植面积大，品种广。它们从中国的黑龙江、新疆、海南、青海，西藏高原分布到东海岸，但大部分还是位于长江流域。我国种植的油菜可以分为白菜型、芥菜型和甘蓝型。其中，长江流域种植的是甘蓝型油菜，因为它与其他品种相比具有抗逆性强、产量又高的特点^[2]。

1.3种子的休眠及其分类

种子的休眠是指把一些有活力的健康的成熟种子置于适宜的物理环境条件中，但是这些种子仍然无法完成萌发^[3]。种子休眠依据休眠期的不同可分为初生休眠和次生休眠^[4]。初生休眠是母体中的种子停止生长，进入休眠状态，它是一种受母体、物理和化学因素影响的先天休眠，而次生休眠则是指在体外萌发的成熟种子由外界环境诱导进入休眠状态的现象^[5]。

种子休眠是种子在生理上的自我保护机制。它能帮助种子面对残酷的外界环境变化、维持物种的生存繁衍。在长期的系统演变过程中，帮助种子在恶劣的生活环境中保持活力，避免伤害。

1.4种子初生休眠机制

种子休眠可以帮助种子延迟萌发，用以躲避不良的外界环境，让种子得以生存。基因和外界环境的共同作用才会导致种子的休眠。休眠的破除受环境和内源信号的协调控制，具有协同效应和竞争效应。植物激素脱落酸(ABA)促进种子休眠的诱导和维持，而赤霉素 (GA)打破休眠并促进种子萌发^[6]。种子休眠机理的研究一直是生物学研究中未知的生物学现象之一^[7]。Dormancy在不同程度上导致种子萌发延迟。然而，种子休眠的根本原因是不一致的，包括未成熟胚、生理限制、胚胎周围组织的限制等。研究者们经过大量科学探索和实践研究，积累了丰富的经验和数据资料，得到了一些认可度高的理论学说，主要影响因素有：种子成熟调节因子、植物激素脱落酸(ABA)、休眠特异基因、表观调节因子等。这些调节因子在不同的水平上发挥作用，并导致种子进入休眠状态^[8]。

图1 种子休眠诱导和解除的所有基因

(1)种子成熟调节因子

种子发育主要由胚形成和种子成熟两个阶段组成。转录因子ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3(ABI3) LEAFY COTYLEDON1 (LEC1) LEC2 FUSCA3(FUS3) 在种子成熟和胚胎向植株的转化过程中，在核心调控中起主导作用^[9]。这些转录因子中的任何突变都会导致种子成熟异常，最终导致休眠异常表型等。此外，在单子叶和双子叶植物中存在调节休眠的保守机制，同源基因编码假想的谷氨酸羧肽酶，其打开参与种子成熟和诱导种子休眠的肽信号传导^[10]。

(2)种子休眠的激素调控

在种子休眠过程中，脱落酸(ABA)不仅能诱导种子休眠，而且能抑制种子发育过程中的种子发芽。它的功能是通过复杂的信号通路网络，通过启动ABA的感知来触发下游生理信号传导途径，触发下游信号的级联反应^[11]。赤霉素(GA)与脱落酸(ABA)的拮抗作用，其信号通路组分在休眠过程中促进种子的萌发^[12]。近些年研究表明，生长素作为另一重要激素促进休眠的发生^[13]。

（3）表观遗传修饰基因

由图1可知，多个表观遗传因子参与休眠过程。表观遗传主要包含三个方面：DNA甲基化、组蛋白修饰（染色质重塑）和非编码RNA^[14]。其中，多个组蛋白修饰因子如HUB1、VIP、ELF等参与休眠过程被报道）。相比而言，非编码RNA代谢及作用过程因子参与休眠的报道较少。

（4）休眠特异性基因

以往的研究发现，控制种子休眠的一些数量性状位点(QTL)，这些数量性状位点与已知的休眠调节剂不同。Arabidopsis thaliana是首次被克隆的休眠数量性状基因座缺失种子(DOG1)，编码一种功能未知的蛋白质。DOG1突变体显示休眠缺失，在其它方面没有明显的发育表型，表明DOG1是诱导种子休眠的关键因素^{[15, 16]}。研究人员还定位了与作物发芽特性相关的QTL，其中Seeddormancy4(Sdr4)已被认为是调控水稻休眠的主要基因之一。同时，发现Sdr4对几种DOG1-like基因的表达有影响（水稻DOG1基因功能类似于拟南芥DOG1）^[17]。由于Sdr4编码功能未知的新蛋白，其作用机制尚不清楚。这些新的影响因子的功能鉴定和其他休眠相关QTLs的定位，将为进一步剖析休眠诱导和维持调控机制提供更多线索。利用转录组和蛋白质组学数据结合反向遗传学可以获得候选基因。

1.5油菜种子的次生休眠

油菜种子几乎不具有初生休眠现象，但具有不同程度的次生休眠现象。

1.5.1油菜种子次生休眠的发生

次生休眠是由后天诱导的，当种子掉落土壤中遇到适宜的环境条件可解除休眠而萌发，但是遇到不良环境比如高温、低氧、缺乏光照、缺水，种子可被诱导产生次生休眠而不能萌发。种子在休眠与非休眠之间的转换的特性可使种子通过自身调节使种子避开不利环境影响，而选择有利的季节萌发，使植物繁衍传代。油菜种子具有明显的次生休眠特性，在适宜条件下种子会打破休眠而萌发，使得地下种子库持续存在形成杂草，因此次生休眠被认为是田间杂草和污染源的一个重要原因^[18]。

由于油菜籽是角果，在成熟和收获期间开裂会导致大量的油菜角果开裂。加上耕作中的翻耕深埋和机械化的收割方式，都会让大量油菜种子进入当下并不适宜发芽的各种物理环境组合中，极易诱发次生休眠现象^{[18, 19]}。

1.5.2次生休眠造成的危害及影响

（1）由于油菜角果易开裂，机械化采收方式会造成大量的落粒现象。在收获期间意外落入土壤的种子可诱导进行二次休眠，这是油菜自发幼苗的潜在来源，将在下个季节甚至几年后萌芽。

（2）大量的自生苗作为杂草，他们会在季节内与其他正常生长的作物竞争土壤肥力，光泽和营养等自然环境资源，导致产量严重下降。

（3）即使下一季作物还是油菜，油菜籽的质量还是会有不同程度的降低，并且对纯品系的污染尤其是当低芥酸和高芥酸品种混杂时，这种伤害的影响将会扩大。另外，近年来大量转基因油菜的应用，一旦转基因油菜幼苗通过异交授粉遗传漂移，将导致严重的生物安全性问题。

现阶段，油菜籽产品的开发，应用和推广涉及人类食用油，动物饲料产品和工业用油等。油菜次生休眠导致的自生苗问题已成为一种新型的污染，阻碍油菜产业未来的发展前景。面对世界范围内日益严重的油菜自生苗问题，我们要注意如何有效地减少油菜自我生产引起的问题。但如果要彻底解决这个问题，减少自生油菜苗的发生，方法应该是选择和改良无次生休眠性状的品种，最终从根本上减少并最终克服自生苗的问题^[20]。

1.6次生休眠研究进展

截至目前，次生休眠的本质至今尚不清楚，其遗传基础和分子调控机制几乎仍是个空白。通过正向或反向遗传学手段获得次生休眠基因的研究还未见报道。目前，检测到Express617×R53构建的遗传群体次生休眠的QTLs。在染色体A5，C3，C5和C8上共检测到4个主要QTL，共能解释42%的表型变异。此外，通过对BnaDOG1进行反向研究，表明其在种子中特异表达，并且在次生休眠前后表现出明显差异，暗示其可能参与次生休眠。

1.7 BnaHEN1参与次生休眠的研究背景

在前期研究中，我们利用PEG6000诱导次生休眠的检测方法，筛选出次生休眠能力较强品种16b-Z-Z-Z和较弱品种11-Z-Z-Z。通过RNA-seq手段，我们筛选出表观修饰因子BnaHEN1在上述强弱休眠品种中表现出较大水平的差异，暗示其可能参与次生休眠过程。正如上文提到的，多个表观修饰因子参与种子休眠过程。为进一步验证其参与次生休眠的功能，本研究对其组织表达模式进行了分析。

2.实验材料与研究方法

2.1实验材料

本研究选用油菜品种16b-z-z-z作为实验材料。

2.2实验方法

1.植物总RNA的提取

参照Takara公司TaKaRa RNAiso Reagent说明书步骤，略有改动。

1. 反转录

参照TIANGEN公司的反转录试剂盒说明书。

3.定量PCR

请参阅TaKaRa SYBR Premix Ex Taq试剂及CFX real-time PCR instrument (Bio-Rad) 说明。

3．实验结果

油菜种子次生休眠性状的遗传基础和分子机制至今仍不清楚。前期，通过RNA-seq筛选差异表达基因的方法，我们鉴定到BnaHEN1基因在休眠种子中具有明显的下调表达，暗示其可能参与种子的次生休眠过程。为明确BnaHEN1在次生休眠中的功能，我们首先对其进行了组织表达模式的检测。

3.1.不同组织RNA的提取

未检测BnaHEN1的组织表达模式，我们对其幼年期的根、茎、叶、小苗以及成熟期的7天、14天、21天和28天的种子进行了总RNA的提取，电泳结果如下图所示：

图2.不同组织RNA的提取

从上图可知，提取的总RNA可见明显清晰的三条带28S、18S和5S，并且28S条带亮度最高，5S亮度最弱，28S的亮度约是18S亮度的2倍，表明RNA完整性良好，可以用于下游的反转录反应。另外，通过测定RNA的浓度进行1μg总量反转录。

3.2.BnaHEN1基因特异定量引物的设计

序列比对采用在线引物设计软件http://Biopiel.U.E./Prime3/，设计特异引物序列，并选用PAGE纯化方式。

引物名称	引物序列(5"to3")	碱基数	纯化方式
HEN1-F1	CTGATAGTCTCAACACCAAACTTCG	25	PAGE
HEN1-R1	GTCCTTCTGCTACACTCTCAACAGC	25	PAGE

3.3 BnaHEN1基因特异性扩增检测

使用上述合成的引物进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示在图中。

图3. BnaHEN1基因特异性扩增

通过与DNA Marker比对，扩增产物条带单一，大小介于250bp-500bp之间。通过引物序列分析，理论上应扩增得到的产物大小为298bp，介于250bp-500bp之间，表明所扩增产物即为BnaHEN1基因。

3.4测序分析扩增产物序列

为进一步确定扩增得到的产物即为BnaHEN1基因，我们对扩增得到的产物进行了DNA测序，通过OMEGA软件，比对如图：

图4. 产物DNA测序图

如上图所示，扩增产物的序列与网站公布的序列比对结果完全一致，表明扩增产物即为BnaHEN1基因，说明该引物可以用于进行实时荧光定量PCR。

3.5实时荧光定量PCR的熔解曲线分析

利用上述引物，我们进行了实时荧光定量PCR。为检测产物特异性，我们进行了熔解曲线的分析。如图所示，BnaHEN1基因在85℃左右具有单一的锐利的峰，说明在荧光定量PCR中产物是唯一的，该引物可以用于进行实时荧光定量PCR的检测。

图5. BnaHEN1基因的熔解曲线

3.6.BnaHEN1基因的组织表达模式

通过实时定量PCR检测，我们发现BnaHEN1基因在各种组织中组成型表达，但是在14天种子中表达水平最高，约是根中表达水平的6倍左右。而随着种子的成熟，其在种子中的表达水平会有所下降。但是由于取材的截止日期受限，我们并未对后期种子进行取材。接下来，我们将进行后期种子取材，实时荧光定量PCR检测其表达水平，以便更准确地分析不同组织中的表达模式以及种子成熟过程中的变化趋势。

图6.BnaHEN1基因的组织表达模式

4.讨论

前期研究报道，表观遗传修饰因子参与种子休眠过程。但是，小RNA代谢组分参与种子休眠的报道仍然较少。我们通过RNA-seq测序筛选到BnaHEN1在次生休眠前后表达水平发生明显的下降，暗示其可能参与次生休眠过程。本研究通过收取不同组织材料进行实时荧光定量PCR，结果表明，其在14天种子中表达水平最高，与次生休眠的表型发生部位一致。接下来，我们将继续取材，观察该基因在种子成熟过程中的表达变化以及休眠前后的表达是否有明显差异。

5.结论

通过对油菜不同组织取材进行BnaHEN1基因的组织表达模式分析，我们发现BnaHEN1在不同组织中组成型表达，但是在14天种子中表达水平最高，伴随着种子的成熟，至28天时表达水平逐渐下降。由于取材时间受限，我们接下来仍然会进行取材以及定量检测，观察该基因在种子成熟过程中及成熟后的变化规律。

参考文献

[1] 关周博, 田建华, 董育红. 我国油菜发展的现状、面临的问题以及应对策略[J]. 陕西农业科学, 2016(3):99-101.DOI:10.3969/j.issn.0488-5368.2016.03.030.

[2] 杨红旗, 徐艳华. 我国油菜生产现状与发展[J]. 种子世界, 2010(7):1-2.DOI:10.3969/j.issn.1000-8071.2010.07.001.

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