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摘 要

亮氨酸脱氢酶是一种NAD 依赖型的氧化还原酶，它可逆地催化L-亮氨酸和一些支链L-氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物，在催化制备L-亮氨酸、叔亮氨酸等方面具有一定的优势。本文采用经典的PCR技术扩增了蜡状芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶基因LDH-14579，并经过TA克隆方法将该基因克隆到了T载体上。为进一步构建亮氨酸脱氢酶重组表达载体，以及表达，纯化和酶学特性研究提供了必要的材料和理论支撑。

关键词：蜡状芽孢杆菌，LDH，克隆，序列分析

Abstract: Leucine dehydrogenase is an NAD -dependent oxidoreductase that reversibly catalyzes the reaction of L-leucine with some branched L-amino acids to produce the corresponding keto acids and their analogues. It has certain advantages in catalytic preparation of L- leucine and tertiary leucine. In this paper, classical PCR technique was used to amplify the LDH-14579 gene of Bacillus cereus, and TA cloning method cloned this gene into T vector. It provides the necessary material and theoretical support for further construct the recombinant expression vector of leucine dehydrogenase, as well as the expression, purification and enzymatic properties.

Key words: Bacillus cereus，LDH，Clone，Sequence analysis

目 录

1 前言 4

2 材料与方法 4

2.1 培养基、材料 4

2.2 供试菌株及培养方法 5

2.3 蜡样芽胞杆菌LDH基因序列获取及分析 5

2.4 设计合成PCR引物 6

2.5 PCR扩增LDH-14579基因 6

2.6 PCR产物回收 6

2.7 PCR产物 TA克隆 7

2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备及转化 7

2.8.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备 7

2.8.2 转化 7

2.9 阳性转化子筛选及测序分析 7

3 结果分析 7

3.1 LDH-14579基因序列分析及引物设计与合成 7

3.1.1 引物设计 7

3.1.2 引物合成 8

3.2 LDH-14579基因PCR扩增 8

3.3 LDH-14579基因PCR产物TA克隆 9

3.4 T-LDH质粒酶切验证 10

3.5 阳性转化子测序分析 10

参考文献 12

致谢 13

附录1 14

附录2 15

1 前言

Leucine Dehydrogenase是一个NAD 依赖的氧化还原酶，将多种酮酸类化合物还原为相应的手性氨基酸^[1]，能够可逆性的催化L-亮氨酸及其它一些脂肪族支链氨基酸发生脱氨基作用，进而转化为a-酮酸及其类似物，其主要参与支链中L-氨基酸的代谢^[2]。在1961年，ShanWar和Zink第一次发现并在蜡状芽孢杆菌中纯化出了LDH。在尿素脱氢酶偶联法中，LDH也可以用来测定血清中的尿素，拥有出色的抗内源氨的干扰能力^[3]。

工业上生产L-亮氨酸主要有提取法、化学合成法、酶催化法。化学合成法操作步骤繁琐而且容易造成污染；而酶法工艺简单，反应条件温和，效益好，污染少。因此工业上更多采用酶法制备亮氨酸^[2]。

本文扩增了蜡状芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶基因LDH-14579，经过TA克隆方法将该基因克隆到了T载体上，并对其进行了序列分析，其中涉及到的主要的技术手段为PCR和TA克隆。

自从Mullis等人在1985年发明了PCR技术以来^[4]，经过30多年的发展，PCR技术已经取得了长足的进步，目前已有巢式PCR、多重PCR、锚定PCR、荧光定量PCR等多种形式的PCR技术，满足了现代生物学科研探究的需要。而T载体因其快速、高效、操作简单地特点，被广泛的应用于各种基因克隆操作中。

PCR技术是模拟DNA在体内的复制过程，在dNTPS、引物、模板DNA、taq聚合酶四个反应要素存在下，经过变性、退火、延伸三个基本步骤实现DNA快速大量扩增的技术。因其操作简便，结果可靠的特点，PCR技术被应用于多个涉及到基因研究和分析的领域，对分子生物学的发展产生了深远的影响。

TA克隆是利用耐热聚合酶具有转移酶活性，而不具有3’-5’外切酶活性的特性，在PCR产物的两个3’端加上未配对的单一A凸出尾，质粒载体提供线性3’末端单一的T凸出尾，使该载体能够直接与PCR产物高效连接^[5]。

鉴于亮氨酸巨大的的工业价值和酶法制备亮氨酸的诸多优势，本文选取蜡样芽胞杆菌亮氨酸脱氢酶基因为材料对其进行扩增及序列分析，以期对进一步构建亮氨酸脱氢酶重组表达载体，以及表达，纯化和酶学特性研究提供帮助。

2 材料与方法

2.1 培养基、材料

液体LB培养基：蛋白胨（OXID）10g，酵母粉(OXID)5g，NaCl 5g，去离子水1000mL，pH自然^[6]。

固体LB培养基：在固体培养基配方中加入15g琼脂粉。

抗性平板：100℃融化LB固体培养基，冷却至60℃左右时加入50mg/L氨苄抗生素^[7]。

PCR扩增仪、DNA回收试剂盒（UNIQ）、水浴锅、培养皿、离心机、离心管、摇床。

2.2 供试菌株及培养方法

大肠杆菌DH5a菌株、蜡样芽胞杆菌菌株。

将蜡状芽孢杆菌菌株和Coli DH5a菌株分别接种到LB固体培养基中，平板划线后37℃培养过夜。如图1图2，蜡状芽孢杆菌14579菌株菌落大，不规则，表面粗糙，且呈现乳白色；DH5a菌株较透明，规则，表面光滑，且菌落较小。

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