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附录A 外文参考文献（译文）

碳纳米管作为植物生长调节剂：对番茄生长，繁殖系统和土壤微生物群落的影响

Mariya V. Khodakovskaya,* Bong-Soo Kim, Jong Nam Kim,
 Mohammad Alimohammadi, Enkeleda Dervishi, Thikra Mustafa, and Carl E. Cernigla

摘要 多壁碳纳米管（CNTs）可以影响植物表型和土壤微生物群的组成。与在对照土壤中生长的植物相比，在补充有CNT的土壤中生长的番茄植物产生的花和果实的数量是其两倍。通过变性梯度凝胶电泳和焦磷酸测序分析确定碳纳米管对CNT处理的土壤的微生物群落的影响。系统发育分析表明，蛋白菌和拟杆菌是土壤微生物群落中最主要的群体。发现拟杆菌和硬壁菌门的相对丰度增加，而蛋白菌和Verrucomicorbia随着CNT浓度的增加而减少。比较样本间多样性指数和物种水平种系（OTU）的结果表明，对细菌多样性没有显着影响。

1 介绍

纳米技术的新发现为医学，航空航天，电子和国防工业的许多应用提供了知识和技术平台。[1-3]纳米技术于这些领域的成功应用引起了纳米技术方法用在农业和粮食系统中的兴趣。已经通过实验观察到低剂量的特定类型的纳米颗粒能够激活植物中的生理过程。例如，最佳浓度的二氧化钛纳米粒子能够通过激活光合作用来改善菠菜植物的生长[5,6]。研究小组已经描述了碳纳米管对植物生长和发育的积极影响。因此，记录了洋葱，黄瓜[7]和黑麦草[8]对碳纳米管响应的根生长的增加。我们最近证明，多壁碳纳米管（MWCNTs）可以激活番茄植株的生长[9]，并影响细胞分裂和植物发育所必需的基因的表达。[9,10] Liu等。证明单壁纳米管（SWCNTs）可以穿透烟草细胞的壁和膜。[11]纳米粒子穿透植物细胞的能力引起了人们对使用纳米粒子作为植物智能处理传递系统的可能性的兴趣。[12] Torney等人。已经报道，金顶中孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）能够穿透细胞壁并通过轰击方法将DNA传递到植物细胞中。[13]纳米胶囊可用于向植物递送除草剂。这种方法有可能提供更好的植物组织渗透，并允许缓慢和持续释放除草剂。[14]有一些有趣的报道是关于使用纳米材料作为肥料成分或增强剂的可能性的。Hossail等人。成功充分利用插入脲酶的纳米多孔二氧化硅，以更好地控制尿素肥料的氨释放。[15] 在另一项研究中，锌铝层双氢氧化物纳米复合材料用于控制植物生长调节剂（NAA）的释放。[16] 最近发现的纳米材料对植物细胞和整个植物生物体的独特影响已经促进了纳米材料在植物生物技术，作物管理，非食用植物生产和生物燃料工业中的使用的增加。然而，指导纳米技术成功应用研究应该解决的一个关键问题是纳米材料对人类的毒性及其对环境的影响。[17]根据最近的预测，用于不同应用的大量工程纳米材料的生产可能导致陆地和水生生态系统的污染。[18]物理和结构性质的变化以及人造纳米材料尺寸的显着减小可能导致对植物，动物和人类的不可预测的影响。[19,20]在土壤，地表或地面受纳米污染的情况下水，植物很容易吸收和积累人造纳米粒子。Zhu等人的一项研究揭示了生长在含有纳米Fe3O4颗粒的水性介质中的南瓜植物可以吸收，转移和积累植物组织中的颗粒。[21]暴露于C70（富勒烯）的水稻植物中碳纳米颗粒的动态摄取和分布[22]已经被Lin等人报道了。因此，在常规浇水期间在供应有多壁碳纳米管的土壤中生长的番茄植物的果实中通过拉曼光谱检测碳纳米管。纳米材料作为植物生长调节剂的广泛使用可能导致其在垃圾填埋场中的积累，并因此可能影响土壤微生物群落。微生物群落的改变可能导致细菌多样性的不平衡或转变，影响它们在已建立的土壤栖息地中的功能作用。然而，很少有关于纳米粒子对土壤微生物的毒性的研究。Gajjar等人报道过人造的Ag，CuO和ZnO组分对土壤细菌分离物 Pseudomonas假单细胞菌 putida KT2440有毒性作用。[23]高浓度的多壁碳纳米管;（ge;500mu;g/ g土壤）会影响土壤中的微生物活性和生物量。[24] 相比之下，其他研究人员发现碳纳米材料富勒烯（土壤中引入的C60 [25,26]对土壤微生物群落的结构和功能影响不大。在该研究中，研究了在浇水期间递送的CNT对成熟番茄植物的表型的影响。我们确定，与未暴露于CNT的植物相比，通过浇灌土壤混合物将CNT施用于番茄植物可以增加花和果实的产量。我们还探讨了碳纳米粒子作为生长调节剂对植物土壤栖息地微生物群组成的影响。土壤是释放到环境中的碳纳米材料的主要接收者之一。为了研究碳纳米管对土壤微生物群的影响，我们使用变性梯度凝胶电泳（DGGE）和焦磷酸测序技术与细菌16S rRNA基因。结果分析表明了CNT处理对土壤微生物群组成的影响。总之，本报告中的数据为确定与使用碳纳米管作为植物生长调节剂相关的潜在环境影响提供了有价值的信息。尽管所有描述的实验都是在实验室环境中的植物生长室中进行的，但实验被用这种方式设计是为了摹拟在碳纳米管污染的自然环境中可能发生的事件。

2 结果与讨论

2.1 土壤中添加多壁碳纳米管的番茄植株表型分析

以前，我们证明了在琼脂MS培养基中引入多壁碳纳米管或单壁碳纳米管导致在体外纳米管补充培养基中生长的幼小番茄幼苗的生长活化[9]。为了进一步评估碳纳米管在植物生长激活中的潜力，我们研究了土壤中引入的多壁碳纳米管（CNTs）对CNT处理的土壤混合物中从幼苗到成熟植物发育阶段生长的番茄植株表型的影响（图1，图2）。通过超声将CNT分散在水（50mL）中，并以50和200mu;g/ mL的浓度每周一次加入土壤混合物中至番茄植物（每种CNT浓度10株植物）。另外10个植物（对照）仅接受定期浇水。用含有浓度为50mu;g/ mL的活性炭的溶液浇灌第三组植物（AC）。在开花阶段，评估所有3个实验组的总体生长响应。在观察到的生长参数（植物高度，叶数和花数）中，两个参数受到向土壤供应CNT

图1 影响碳纳米管(CNT)提供浇水(50和200mu;g /毫升)表型的番茄植物。测定了CNT暴露于活性炭(AC)和未暴露于番茄(对照)的开花期植株平均株高(A)、叶片数(C)、花数(B、D)。每个数据点是20个单独测量值的平均值。因此，竖条表示plusmn;SE (n=20)的影响。

因此，与暴露于活性炭或对照植物的植物相比，接受CNT的植物的高度差不多但在统计上显着更高（图1A）。在所有实验组之间未观察到发育叶片数量的差异（图1C）。然而，与对照植物或用活性炭处理的植物相比，经CNT处理的番茄植物在两种测试的纳米管浓度（50和 200mu;g/ mL）下产生两倍多的花（图1B，D）。CNT处理的植物花数的增加导致番茄果实产量的相应增加（图2A）。因此，与对照植物和接受活性炭的植物相比，在浇水期间接受CNT溶液的番茄植物每株植物产生两倍多的果实。每株植物的种子数和果实大小不受CNT施用于番茄植物的影响，并且在所有实验组之间相似（图2B，C）。我们的实验表明，通过浇水将碳纳米管输送到植物可以有效激活植物的生殖系统并导致水果产量的增加。观察碳纳米管对植物生殖系统影响的机制将需要进一步细节方面的研究。然而，很可能这种机制与已经记录的碳纳米管激活能够激活植物生长和发育所必需的基因/蛋白质表达的能力有关。以前我们证明低剂量（100-200mu;g/ mL）的CNT可以激活在补充有CNT的无菌琼脂培养基上生长的番茄幼苗中水通道蛋白（水通道蛋白）的表达。[10]众所周知，水通道蛋白是植物生长和发育的关键调节因子。[27]因此，证明了烟草植物中拟南芥水通道蛋白的过表达导致植物生长和光合效率的增加。我们最近观察到CNT可以刺激烟草细胞的生长并激活水通道蛋白的基因和蛋白质表达。[28]此外，与未暴露的细胞相比，暴露于CNT的烟草细胞中细胞分裂和细胞延伸的标记基因上调[28]。这些基因表达研究提供了证据表明碳纳米管具有通过上调植物发育必需基因来影响植物生理的能力。然而，纳米管如何触发特定基因表达的机制仍然是一个悬而未决的问题并且需要进一步的实验。暴露于碳纳米材料的番茄植物的生理反应的差异引发了关于它们的大小，形状和其他性质对这些材料可能引起的生物效应的重要性的问题。我们认为碳纳米管和活性炭之间的性质差异可能对植物生长有很大影响。我们以前曾报道过CNTs的表面电荷对番茄植株中水通道蛋白的生长和表达有影响。[10]我们发现，应用碳纳米管表面官能团的聚集，类型和电荷水平对碳纳米管对番茄幼苗发芽和生长的特殊影响至关重要。[10]此外，当番茄幼苗暴露于具有高负表面电荷的良好分散的功能化CNT时，实现了番茄生长的最高增加。此外，当暴露于这些各种碳纳米材料时，纳米材料之间在尺寸，形状和结晶度方面的巨大差异可能是导致植物中所见差异的主要因素之一。更具体地，与非结晶相对较大的活性炭材料相比，外径仅在25nm范围内的结晶CNT的管状结构可以允许并增强它们与生物系统的进一步吸收和相互作用。与此处呈现的结果类似（图2），活性炭的施用不会引起植物生物量的增加，而应用多壁碳纳米管或单壁碳纳米管导致番茄幼苗的生物量产生的活化。[9]

图2 影响碳纳米管(CNT)提供浇水(50和200mu;g /毫升)对番茄果实的发展。测定了CNT暴露的植株(CNT 50和CNT 200)、活性炭暴露的植株(AC)和未暴露的番茄植株(对照)在成熟阶段(红色)的平均果实数(A)、单果种子数(B)和果实大小(C)。每个数据点是20个单独测量值的平均值。因此，竖条表示plusmn;SE (n=20)。

2.2 含CNT土壤中番茄生殖系统CNT的检测

为了评估繁殖机体数量增加的影响是否与繁殖机体累积CNT有关，拉曼光谱法被用于检测CNT处理土壤上生长的植物花中纳米管的存在（图3)

图3 cntaggregatesintomatof(A,B)的拉曼散射检测基于单个CNTs的光谱特性。它可以清楚地观察到的1587厘米minus;1沿表面面的峰值在⼏几个地方方花从碳纳米管的表面面暴暴露的植物(C)。这个峰值对应的G带微碳纳米管并没有发现在控制样品(未经处理的植物的花)。这些研究使用用了功率为5mw的633纳米激光激发。

鉴于碳纳米管的独特光谱特征，拉曼光谱是最敏感的方法之一，可以非破坏性地分析这些纳米材料在植物器官和植物细胞中的存在。[9,10]拉曼分析清楚地表明存在 在花结构中聚集CNT（图3）。这些分析完成于对从暴露于CNT的植物收集的花中，并且我们证明了G带的存在和强度，这是纳米管的特征。在对照样品中未检测到CNT-特征G峰（1587cm-1），清楚地表明CNT在植物系统内分布并到达花。这些结果与我们以前的研究非常吻合，这些研究通过拉曼，光热和光声光谱学清楚地表明，碳纳米管到达用纳米管浇灌的番茄植物的叶子和果实。[9]因此，我们可以得出结论，当暴露于纳米管时，CNT的摄取相对容易发生并分布在番茄植物内。这些观察提出了一个关于使用碳纳米材料作为粮食作物生长调节剂的安全性的重要问题。使用碳纳米材料激活生物量生产或调节生殖发育阶段可能更适合农业和园艺的非食品部门。可以认为碳纳米管可能具有调节观赏植物，生物燃料作物，专门用于提取代谢物和蛋白质的植物生长的潜力。然而，即使是暴露于CNT的非食用植物也可以作为纳米材料进入食物链并影响包括微生物群在内的土壤生态系统的潜在途径。应考虑对纳米暴露的植物器官（叶，根，果实，种子）对动物的毒性以及此类纳米材料残留物对土壤微生物群落的影响进行综合评估，以确保人类和环境健康。开发用于定量测量纳米材料在不同植物器官中的摄取和分布的新分析技术是未来研究的另一个重要途径。

2.3 CNT处理土壤微生物群的DGGE图谱

通过浇水实践将碳纳米管添加到土壤中会影响与土壤环境相互作用的微生物。为了评估与土壤CNT污染相关的环境影响，我们分析了来自表型实验的土壤样品，以便对土壤微生物群落进行综合分析。采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法初步筛选土壤样品中微生物群落的差异。进行DGGE概况以比较具有不同CNT处理的土壤之间的细菌群落（图4A）

图4 (A)利用用骰子子系数(B)对DGGE剖面进行聚类分析。利用用BioNumerics程序中的归一一化凝胶剖面面生生成树木图。“M”指示标志,紧随其后的是“问”代表对碳纳米米管的浓度(50或200mu;g /毫升)。

虽然在每个测试组的一式三份土壤样品中观察到一些变化，但我们可以统计比较对照土壤样品中细菌群落的DGGE图谱与来自每个CNT处理组的样本。通过DGGE凝胶谱的聚类

分析来分析群落组成的这些变化和差异。图4B显示DGGE图谱聚集为具有每个浓度的碳纳米管处理的土壤的图案。CNT 50样品（50mu;g/ mL的CNT）聚集在一起，一式三份样品之间平均相似性为89.6％。CNT 0（r9）的一个谱与其他两个CNT 0样品（对照）具有81.4％的相似性，并且与所有CNT 50样品具有83.6％的相似性（平均值）。CNT 200（r7）谱与其他两个CNT 200样品（200mu;g/ mL CNT）具有69.5％的相似性，但与CNT 50样品具有超过76.7％的相似性。这些相似性表明，一式三份的CNT 0和200个样品与CNT 50样品组聚集。CNT 0和CNT 200样品中聚集的谱的相似性分别为94.3％和83.02％。CNT 50曲线与CNT 0曲线群的相似性高于CNT 200（74.2％）的相似性（平均相似度的78.6％）。样品之间的这些相似性代表了处理不同浓度的CNT的土壤样品之间细菌群落的同源性。CNT 0（对照）和CNT 50之间的相似性高于CNT 50和CNT 200，表明细菌群落的差

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