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摘 要

本文采用红酵母( Rhodotorula )发酵生产类胡萝卜素,并对其产类胡萝卜素的提取方法进行了较详细的筛选和优化研究。结果表明,酸热法是红酵母破壁较理想的方法,其最优条件组合为盐酸的浓度2 mol/L、用量12 mL/0.1 g菌体、浸泡时间40 min和沸水浴时间3 min;丙酮:石油醚=1:1 ( v/v )是从红酵母细胞碎片浸提类胡萝卜素较好的有机溶剂,其参考用量为10 ml/0.1 g菌体。在此破壁和浸提方法的条件下,采用高效液相色谱法( HPLC )测定红酵母中类胡萝卜素的含量。

关键词：红酵母类，类胡萝卜素，酸-热水解法

Abstract: The extraction methods of carotenoid produced from Rhodotorula fermentation were studied in this paper.The experimental results showed that the method of acid-hot water solution was suitable for the cell repturing from Rhodotorula,and the optimal conditions were as follows: HCL concentration 2 mol/L, HCL addition 12 mL/0.1g (dry cells), soak time 40 min and heating time 3 min. Acetone-petroleumether (1:1 v/v) of 10 ml/0.1 g ( dry cells ) was the best solvent for carotenoid extraction . Under the above optimal conditions, the sample of carotenoid in red yeast ( Rhodotorula ) was analyzed by HPLC.

Keywords: Rhodotorula,carotenoids,acid-hot water solution

目录

1 引言 4

2 材料与方法 6

2.1 材料 6

2.1.1 菌种 6

2.1.2 培养基 6

2.1.3 仪器设备 7

2.2 方法 7

2.2.1 菌株培养 7

2.2.2 干细胞的获得 7

2.2.3 色素提取方法的选择 8

2.2.3.1 研磨法 8

2.2.3.4 细胞自溶法 8

2.2.4 HPLC定量分析色素 8

3 结果与分析 9

3.1 b-胡萝卜素标准品最大吸收波长的确定 9

3.2 b-胡萝卜素标准曲线 9

3.3 提取方法的选择 10

3.4 酸—热水解法提取色素的优化 11

3.5 酵母色素HPLC分析结果 13

结论 15

参考文献 16

致 谢 17

1 引言

在日常的生活生产中,色素越来越发挥着不可替代的作用。特别是在食品行业中,色素在赋予食品诱人的色泽光度，在给我们视觉上的美感的同时，也拉动了消费^[1]。

类胡萝卜素(Carotenoids)是一种广泛存在于藻类光合组织、微生物以及植物的颜色呈红色、橙黄色或者黄色的脂溶性四萜烯类化合物^[2-4]。类胡萝卜素是由8个类异戊二烯单位组成的一类碳氢化合物及其氧化衍生物。其基本结构是番茄红素,另外其他的类胡萝卜素是由番茄红素氧化、氢化、脱氢、环化以及碳架重排、降解而衍生。一般类胡萝卜素都是C40分子，但是高类胡萝卜素(如C45和C50)和降解的类胡萝卜素(如C30)也是存在的^[5]。类胡萝卜素通常分为两大类：胡萝卜素和叶黄素。前者是以-胡萝卜素为代表，仅含碳、氢两种元素，后者是前者的含氧衍生物，比如虾青素。另一种分类方式是将胡萝卜素分为链状、单环和双环衍生物三种，它们的代表化合物分别为番茄红素、γ-胡萝卜素以及-胡萝卜素^[6]，即类胡萝卜素主要包括虾青素、叶黄素-胡萝卜素、以及番茄红素等^[7]。

类胡萝卜素家族中的典型色素是-胡萝卜素，它在许多植物组织和一些微生物的细胞中存在，其结构中含有两分子的维生素A，是一类维生素A源，活性很强。它是一种不饱和的碳氢化合物（C₄₀H₅₆），是由异戊二烯组成的多烯类化合物。Blumberg^[8]1994年在柏林总结召开的第二届抗氧化剂维生素中的作用(在预防疾病)的国际会议时指出，-胡萝卜素的功能可以有以下几个方面：1.由于-胡萝卜素是维生素A的前体，且维生素A是人体必需的微量营养成分，因此在临床上通常用于治疗维生素A缺乏症；2.由于-胡萝卜素具有免疫功能，因此其可以使巨噬细胞免受自身氧化的损失，并能提高人体免疫系统抵抗病原物的能力；3.由于-胡萝卜素具有抗氧化剂的功能，因此能淬灭单线态氧和清除体内自由基的不良影响, 世界卫生组织早在1989年就确认最有希望的抗氧化剂为-胡萝卜素^[9]；4.能预防癌症，控制癌症的发展；5.促进细胞间联接交流，从而抑制或降低癌症的发生。因此，作为一种食品添加剂、营养补充剂，-胡萝卜素已经被欧共体、日本、FDA和WTO等国际组织以及专家所认可，并且如今已被广泛地应用于保健品、食品、药品及饲料中^[10]。

市场上目前存在化学合成-胡萝卜素和天然-胡萝卜素2种。从化学结构上来说，天然类胡萝卜素除了-异构体外，还有和γ-异构体；而化学合成品全都是-异构体；天然-胡萝卜素具有顺反2种结构;而化学合成的-胡萝卜素只有反式结构。从抗氧化和人体内的吸收率方面来说，天然型均高于合成型^[11]。从功能上来说，化学合成法是最方便廉价的方法，但是随着毒理学和分析技术的飞速发展，人们越来越关注合成法生产食用色素的毒性问题，许多国家也相继制定了一系列限制合成色素使用的法律法规^[12]，并且合成-胡萝卜素有可能会致染色体畸变，但是天然-胡萝卜素则有很好的抗染色体畸变作用，特别是最近发现了天然-胡萝卜素在防癌抗癌、防老抗衰^[13]，防辐射以及防治心血管疾病等方面的新功效，市场需求也在不断的增长，其应用也从着色剂渐渐转向保健品、药品、营养食品及添加剂等许多领域扩展到饲用微生物制剂^[14]。因此天然-胡萝卜素要优于化学合成-胡萝卜素。

国内外天然-胡萝卜素的生产方式主要有3种: (1) 从养殖大面积盐藻获得; (2) 提取天然植物（如胡萝卜、番茄等）获得; (3)用微生物发酵生产获得^[15]。从天然植物中提取获得-胡萝卜素的不足有:价格贵、成本高、提取工艺复杂和着色力差等；养殖盐藻不仅需要高温、强烈光照，还需要10%以上的高盐浓度，这些条件都较难实现^[10]；但是通过微生物发酵法生产类胡萝卜素安全无毒，简单方便，并且权威机构还认为此方法获得的类胡萝卜素是天然食品添加剂^[16-17]。微生物发酵法是获得天然类胡萝卜素的一种，主要有红酵母(Rhodotorula)^［18］和三孢布拉霉菌( Blakeslea trispora ) ^[19]被应用到微生物发酵法中。在这两种微生物中，虽然三孢布拉霉菌的发酵产率较红酵母高，但是它也有缺点：例如发酵周期长、成本高、营养要求多、工艺复杂等。红酵母RY010属于红酵母属(Rhodotorula),它是一类腐生菌，广泛的在自然界中存在，从营养方面来说，红酵母含有丰富的维生素、氨基酸和蛋白质, 除了能够用来提取天然-胡萝卜素,同时它的全细胞还能够作为单细胞蛋白( single cell protein, SCP) ,应用于饲料添加剂或水产养殖用料等优点^[20]；从发酵过程来说，它的优点更多,例如营养要求简单,发酵能力强,生长快,周期短,发酵工艺易于调控,发酵过程易于产业化等,具有极高的开发价值和应用前景^[21],并且它还被我国饲料行业已经确认为12种的饲用微生物。因此利用红酵母生产-胡萝卜素是有很大的实用价值的。

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