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摘 要

弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性蛋白为特征的广谱肽链内切酶，广泛应用于医疗卫生、食品加工、日用化工及环境治理等行业，具有极大的经济价值和应用前景。本研究主要是用基因定点突变、PCR技术、质粒提取以及琼脂糖凝胶电泳等分子生物学手段，通过引入N-糖基化位点，来研究N-糖基化位点对重组弹性蛋白酶在毕赤酵母中表达量的影响。

关键词：弹性蛋白酶，N-糖基化位点，定点突变，毕赤酵母

Abstract: Elastase is a kind of broad spectrum endonuclease peptide chain, which is characterized by hydrolysis of insoluble elastin. It is widely used in many industries such as health care, food processing, household chemicals and environmental management. It has great economic value and application prospect. The thesis mainly use molecular biology such as gene site-directed mutation, PCR technique, plasmid extraction, and agarosegel electrophoresis introduced N-glycosylation sites to study the influences of N-glycosylation sites on the elastase expression in Pichia pastoris.

Keywords: elastase, N-glycosylation sites, site-directed mutagenesis, Pichia pastoris

目 录

1 前言 3

2 实验材料 4

2.1 质粒和菌株 4

2.2 酶和试剂及各试剂配制方法 4

2.2.1 酶和试剂 4

2.2.2 试剂配制方法 4

2.2.3 培养基配制方法 5

2.3 实验仪器 5

3 实验方法 6

3.1 PCR定点突变引入糖基化位点 6

3.1.1 PCR引物设计规则： 6

3.1.2 设计引物 6

3.1.3 PCR 6

3.1.3.1 PCR反应体系 7

3.1.3.2 PCR循环 7

3.1.3.3 消化模板 7

3.2 大肠杆菌(DH5α)感受态制备和目的基因的转化 8

3.2.1 感受态制备 8

3.2.2 转化 8

3.3 摇瓶培养提取质粒并测序 8

3.4 目的基因的亚克隆 9

3.4.1 提取质粒 9

3.4.2 双酶切 9

3.4.2.1 EcoRI酶切 9

3.4.2.2 乙醇沉淀DNA 9

3.4.2.3 AvrII酶双酶切 9

3.4.3 连接 10

3.5 再次转化筛选阳性克隆 10

3.5.1 电转化毕赤酵母 10

3.5.1.1 毕赤酵母感受态制备  10

3.5.1.2 将成功筛选出的菌种质粒用SacI酶切处理线性化 11

3.5.1.3 电击转化  11

3.5.2 毕赤酵母诱导产酶培养 11

3.5.3 蛋白酶的测定 11

3.5.4 SDS-PAGE电泳 11

3.5.4.1 制备双层凝胶 11

3.5.4.2 SDS-PAGE胶染色 12

4 实验结果与讨论 12

4.1 含有目的基因的PT4质粒PCR定点突变 12

4.2 克隆质粒转入受体细胞 12

4.3 双酶切 12

4.4 重组质粒的双酶切鉴定 13

4.5 成功筛选出的电泳图 14

4.6 重组表达质粒pPIC9K的鉴定 14

4.7 重组酵母的转化和诱导产酶 15

4.8 重组酵母诱导表达和SDS-PAGE的鉴定 15

结论 17

参考文献 18

致 谢 20

1 前言

弹性蛋白酶psudolysin是由Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）产生的，又名Pseudomonas aeruginosa elastase（PAE），它为一种以水解不溶性的广谱蛋白水解酶^[1]。弹性蛋白酶主要存在于动物的胰脏中，在皮肤、主动脉、血小板和白血球中也有分布，用来催化水解弹性蛋白，蛋白酶是含有锌金属的弹性蛋白酶。弹性蛋白酶水解不溶性蛋白的效率远远比其他蛋白酶高，并且已经在多个领域广泛应用^[2]。它能够专一性的降解结缔组织中坚韧的弹性纤维组分，尤其是对肉类具有选择性嫩化作用，但是又不破坏其它成分，达到既对肉类嫩化而又不失其风味的目的，可以作为理想的肉类嫩化剂。另外，弹性蛋白酶在农副产品深加工、废弃羽毛蛋白资源利用和在有机溶剂中肽合成方面也有广泛的应用。然而，弹性蛋白酶的天然生产菌株P. aeruginosa是一种条件致病微生物，如要安全地应用弹性蛋白酶，必须将其基因在安全宿主中表达。毕赤酵母作为一种安全的、高效的、利于培养的表达宿主，具有高密度培养和翻译后修饰能力等优点，因此，将lasB基因在毕赤酵母中表达可以促进弹性蛋白酶的实际工业化生产和应用^[3]。

之前国内获得弹性蛋白酶的方法仅是从胰脏中提取，受到脏器资料及生产工艺的限制，不但成本较高，而且产量较低，大大落后与市场需求^[2]。自从国内外开始广泛开展利用微生物发酵生产弹性蛋白酶的方法后，在一定程度上缓解了工业用酶的需求，如肉类嫩化剂、化妆品添加剂等。但作为医用生化药物的酶仍然有很大的局限，这主要是由于用微生物来发酵生产的弹性蛋白酶在生物安全性以及毒理方面还有一定的不足，其产品的活性和纯度还达不到要求。近年来，随着对环保要求的日益提高，制革生物技术开始受到更大的关注。弹性蛋白酶作为一类清洁材料，替代传统的化学用品，开始被广泛地应用于浸水、脱毛和软化等制革工序中，得以减少传统化学品的污染^{[3, 4]}。

毕赤酵母作为真核微生物，可以进行许多类似哺乳动物细胞的翻译后修饰，包括二硫键的形成、信号赋序列的加工、折叠、糖基化及脂类酰化等^[5]。它作为一种成功的外源基因表达系统，越来越广泛被应用。毕赤酵母表达系统的优点在于操作简便、经济，能够进行复杂的翻译后加工，并且表达水平高。目前研究最多的主要是是糖基化作用，蛋白质的糖基化链在细胞识别、指导蛋白质的正确折叠、激素与受体的结合、蛋白质定位等方面都具有重要作用^[6]。毕赤酵母能对表达的弹性蛋白进行N-糖基化和O-糖基化^[7~9]，其中N-糖基化对于许多弹性蛋白的正确折叠、药物动力学稳定性和功能也是必需的，人们对N-糖基化的研究也相对深入。

近年来，毕赤酵母表达系统已被认为是极为成功的外源蛋白表达系统之一^[10]，以酵母作为工程菌表达外源蛋白的途径也日益引起研究单位的重视。酵母是低等真核生物，与大肠杆菌相比，不但具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，而且具有真核生物对表达的蛋白质进行正确的加工，修饰，合理的空间折叠等功能，能有效的克服大肠杆菌系统缺乏对蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此毕赤酵母非常有利于真核基因的表达，其表达系统也受到越来越多的重视和利用。

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