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摘 要

本研究利用Cre-LoxP特异性的重组位点，将含有Cre基因和带有LoxP位点的外源基因分别转入烟草，获得两种不同的转基因植株，再将两种不同的转基因植株进行杂交，从而获得没有选择标记的转基因植株，以提高转基因作物的生物安全性。

关键词：Cre基因；LoxP位点；转基因烟草

Abstract:In this study, exogenous genes with Cre gene and LoxP sites were transformed into tobacco respectively to obtain two kinds of different transgenic plants by using the Cre/loxP site-specific recombination. Then the two kinds of different transgenic plants were crossbred to obtain transgenic plants without selection marker in order to improve the biosafety of transgenic crops.

Key word: Cre gene; LoxP sites; transgenic tobacco

目 录

1 前言 5

2 载体构建及遗传转化 5

2.1 载体的构建 5

2.2 转基因烟草的获得与鉴定 7

3 结果与分析 8

3.1 植物表达载体的构建 8

3.2 转pBIL2 35S GFP载体烟草植株的鉴定 8

3.3 转pBIL2 35S GFP载体烟草报告基因的荧光检测 9

3.4 转pBI121 Cre载体烟草植株的鉴定 10

3.5 转pBI121 Cre载体的烟草形态学变化 10

结 论 12

参 考 文 献 13

致谢 14

1 前言

近年来，基因工程技术在飞速发展，随着转基因作物商业化和产业化的进程不断加快，人们对转基因作物的环境安全性和食品安全性问题的关注也越来越多^[1]。选择标记基因的安全性问题是转基因植物安全性的首要问题。该基因可能会带来生态安全问题，也可能直接或间接影响人类的健康。在遗传转化中，选择标记基因能够大大提高筛选效率，在得到转基因植物后，标记基因就成为赘物，甚至可能是有害的^[2]。因此，培育不带选择标记基因的转基因作物是非常必要的，这一方向已成为植物基因工程的一个重要的发展方向。

目前，培育无选择标记转基因植株的方法主要有共转化法、位点特异性重组系统法及转座子法等。双T-DNA共转化法对转化频率要求很高，且共转化效率很低，不适合应用于无性繁殖的作物中。转座子介导法的删除效率很低，且转座发生后可转座的片段往往会重新插入到基因组中。由于位点特异重组系统删除的精确性和较高的重组频率，在筛选无标记基因作物方面得到了广泛地应用^[3]。位点特异重组系统包括Cre/LoxP系统^[4]、Flp/frt系统^[5]、R/rs系统^[6,7]。在这些方法中，应用最多最广泛的是共转化法和Cre/loxP位点特异性重组系统。Cre酶是一种稳定性较好的蛋白质，该蛋白能够识别34bp的loxp位点，Cre酶在各种组织中，都能够有效表达，且该酶的活性不依赖于任何辅助因子。从生物安全性的角度讲，切除标记基因能够大大提高转基因植株的生物安全性，Cre-loxp体系是一组基因自剔除系统，该体系可以通过表达的Cre和其它外源基因片断置于LoxP位点之间，成功实现外源基因的整体剔除。本研究将Cre基因和带有LoxP位点的外源基因分别转入烟草，将两种转基因烟草进行杂交，从而获得没有选择标记的转基因植株。

2 载体构建及遗传转化

2.1 载体的构建

（1）pBIL2 35S GFP载体的构建

用BglⅡ和EcoRⅠ酶切pZA 35S GFP，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切质粒pBILoxp2，反应体系（100μl）如下：

pBILoxp2 40 pZA 35S GFP 20

BamHⅠ 2 BglⅡ 2.5

EcoRⅠ 2 EcoRⅠ 2.5

EcoRⅠButter 10 EcoRⅠ Butter 10

BSA 1 BSA 1

H₂O 45 H₂O 64

在37℃温浴3小时，用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，最后用22μl的去离子水洗脱，加入2.5μl的T4 DNA连接酶buffer和0.5μl T4 DNA连接酶，22℃连接2～3小时，载体构建过程如图1所示。

·

图1 遗传转化载体pBILoxp2 35S GFP构建图

Fig.1 Construction of heat shock protein promoter transformation vector pBILoxp2 35S GFP

（2）pBI Cre载体

该载体由本实验室构建保存。

图2　试验所用克隆载体结构图

Fig.2 Schematic map of the clone vector used in the experiment

（3） 筛选阳性克隆

将构建好的载体通过热激法转化到感受态大肠杆菌TOP10中。37℃过夜后，挑单克隆于液体LB培养基中，2～3小时后，以菌液为模版，进行PCR扩增。

反应条件为：94℃ 预变性 2min，94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，共25个循环，72℃再延伸2min，来鉴定外源片段是否已装入载体。

2.2 转基因烟草的获得与鉴定

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